基于整合药理学及分子对接技术探讨小青龙汤治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期的分子机制

韩东卫 杨琴琴 王利芳 梁欣 张洪波 张维君

黑龙江中医药大学基础医学院 北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040

慢性阻塞性肺疾病（以下简称“慢阻肺”）是指持续性的气流受限及相应呼吸系统症状[1]。慢阻肺急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）在肺功能减退基础上，合并有气道黏液高分泌、管腔内渗出、小气道炎症等急性并发症[2]。中医可将AECOPD 归属于“喘证”“肺胀”范畴，本虚标实是其发病的基本病机。小青龙汤出自张仲景《伤寒论》，具有解表散寒、温肺化饮之效。多项研究表明，小青龙汤治疗AECOPD 效果确切，且优于单独应用西药治疗[3-4]。

1 材料与方法

1.1 药物成分与靶标

中医药整合药理学平台（integrative pharmacologybased research platform of traditional Chinese medicine，TCMIP）V2.0 平台检索小青龙汤（麻黄、芍药、细辛、干姜、甘草、桂枝、半夏、五味子），构建化学成分库。与DrugBank 化学指纹特征比对，以相似性系数Tanimoto≥0.8 筛选药物候选靶标。以“AECOPD”为关键词检索GeneCards、OMIM 数据库，构建疾病靶标。本研究经黑龙江中医药大学科研伦理委员会审核通过。

1.2 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络

药物-疾病交集靶标，通过度中心性、接近中心性、中介中心性中位数卡值得到核心靶标，导入STRING数据库构建PPI 网络。

1.3 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

STRING 数据库下载潜在靶标的GO 及KEGG 数据，借助微生信在线平台进行富集分析。

1.4 关联网络图构建与可视化分析

借助Cytoscape 3.7.2 软件构建小青龙汤治疗AECOPD 多维网络图。

1.5 分子对接

借助AutoDock 软件进行分子对接处理，ZINC 数据库下载活性成分“mol2”文件，PDB 数据库下载靶点蛋白的3D 晶体结构，用Pymol 软件进行可视化。

2 结果

2.1 小青龙汤化学成分及靶标

TCMIP V2.0 平台检索得到小青龙汤化学成分401 个，候选药物靶标595 个。GeneCards（相关分数＞30 分）与OMIM 检索得到疾病靶标825 个。

2.2 核心靶标筛选

药物-疾病交集靶标58 个，根据中位数卡值得到23 个核心靶标。见图1。

图1 药物-疾病核心靶标

2.3 GO 和KEGG 富集分析

GO 富集分析结果显示，核心靶标主要参与调节免疫反应、对含氧化合物反应等生物过程。KEGG 富集分析结果涉及肿瘤坏死因子、AGEs-RAGE 等信号通路，多与炎症免疫反应、氧化应激及能量代谢过程相关。见图2。

图2 GO 和KEGG 富集分析

2.4 活性成分筛选

以核心靶标反向查找，且满足类药性等级为“Good”“Moderate”的活性成分有41 个。见表1。

表1 小青龙汤治疗AECOPD 的潜在活性成分

2.5 网络可视化

利用Cytoscape 3.7.2 构建“小青龙汤-活性成分-核心靶标-表型-AECOPD”多维网络图。见图3。

图3 多维网络图

2.6 分子对接

结合能＜-6 kcal/mol 的对接结果，见表2。结果显示芍药二酮、异甘草素、2，4，4’-Trihydroxychalcone 与核心靶标中的表皮生长因子、AKT 激酶1、肿瘤坏死因子具有较好的结合能力。见图4。

图4 分子对接可视化

表2 分子对接结果

3 讨论

炎症与免疫、氧化应激均被认为是AECOPD 发病的关键机制[5-8]，本研究经筛选得到23 个核心靶标。其中肿瘤坏死因子、白细胞介素-6 在介导免疫炎症反应中发挥重要作用[9]。多项研究表明，AECOPD 进程中肿瘤坏死因子、白细胞介素-6 的表达显著升高[10-13]。张月[14]研究发现给予AECOPD 患者小青龙汤治疗后，血清中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6 水平显著下降。多项研究表明，肺上皮细胞PI3K、AKT 激酶过度激活与慢阻肺进展密切相关[15-17]。莫碧文等[18]研究表明，小青龙汤可抑制p-AKT 激酶表达改善哮喘气道重塑。有研究发现，表皮生长因子及其受体表皮生长因子R高表达与慢阻肺气道上皮杯状细胞增殖和黏液产生呈正相关[19-20]。

近年来研究表明，黄酮类成分多具有抗炎、抗氧化、调节免疫等作用[21-23]。于维汉等[24]研究表明，槲皮素能抑制细胞炎症介质的形成，抑制白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α 等炎症因子的分泌及表达。山柰酚可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶信号通路对AECOPD 起到保护作用[25]。生物碱类成分可抑制白细胞介素-4、肿瘤坏死因子-α 等细胞因子的释放，减轻气道炎症反应，松弛支气管平滑肌，解除痉挛[26]。

综上所述，本研究通过整合药理学分析小青龙汤的多种活性成分，主要包括黄酮类、生物碱、酚类及少数有机酸类等，可通过抑制肺部炎症及氧化应激恢复肺的正常代谢功能，进而改善AECOPD 进程。