基于主成分分析和隶属函数分析评价不同添加剂处理的玉米秸秆青贮的发酵品质

张志恒 王玉琴,2* 任国艳 李元晓,2 赵凌平 吴秋珏 张子军

(1.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003；2.河南省肉羊繁育工程技术研究中心，洛阳 471003；3.安徽农业大学，合肥 230000)

我国是农业生产大国，每年都会产出大量的农作物秸秆。玉米秸秆作为主要的粮食副产物，是具有巨大潜力的生物可利用资源[1]。但在实际生产中，仅有小部分的秸秆被粉碎还田再利用，大量的玉米秸秆则被丢弃或违规燃烧，不仅造成了环境污染，还浪费了大量的可利用资源[2]。因此，如何高效利用玉米秸秆是目前亟需解决的问题。近年来，随着我国畜牧业的大力发展，玉米秸秆饲料化利用成为新的研究趋势。但玉米秸秆纤维含量较高、适口性差、可利用养分较少，需对其进行加工调制方可投入使用[3]。目前，青贮是处理玉米秸秆的有效手段，其不仅能有效保存玉米秸秆的营养成分，还能在很大程度上提高经济效益。He等[4]报道，使用青贮玉米秸秆饲喂肉牛效果良好，是比较经济的饲喂方式。李杰等[5]比较了青贮玉米秸秆和风干玉米秸秆饲喂肉牛的效果，结果显示，青贮玉米秸秆能显著提高肉牛的生长性能和屠宰性能。因此，青贮是一种较好的秸秆处理方式。但在实际生产中，由于玉米秸秆附着的乳酸菌数量有限，且其自身营养成分含量较低，容易导致玉米秸秆青贮失败[6]，因此常在青贮时加入添加剂以调节发酵进程。目前应用最为广泛的青贮添加剂是乳酸菌制剂。Zhao等[7]报道，在大豆残渣和玉米秸秆混合青贮中添加乳酸菌能显著提升混合青贮的发酵质量及瘤胃降解率。Li等[8]则发现，产阿魏酸酯酶的乳酸菌能够加速玉米秸秆的发酵进程，促进乳酸产生，同时有效降解木质纤维组分。除此之外，枯草芽孢杆菌、纤维素酶和乙酸、丙酸等添加剂也被大量应用到青贮制作中。Lara等[9]研究表明，添加枯草芽孢杆菌能够改善青贮玉米的营养价值和有机物质消化率，同时还能减少青贮玉米中霉菌和酵母菌的数量。Bai等[10]发现，在紫花苜蓿青贮中添加产抗菌肽枯草芽孢杆菌能够提高发酵品质和有氧稳定性，并且降低蛋白质的水解。Cheng等[11]研究发现，在玉米秸秆和饲用大豆混合青贮中使用纤维素酶能够降低中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量，同时提高粗蛋白质(CP)的含量以及干物质(DM)消化率。目前，关于枯草芽孢杆菌和纤维素酶在玉米秸秆青贮中的应用已有报道，但关于产抗菌肽的枯草芽孢杆菌在玉米秸秆青贮中的应用尚未见报道，且前人报道的产抗菌肽枯草芽孢杆菌在苜蓿青贮中应用效果良好。因此，本试验拟对不同添加剂量的产抗菌肽枯草芽孢杆菌和纤维素酶处理的玉米秸秆青贮的发酵品质进行测定分析，旨在评定这2种添加剂在玉米秸秆青贮中的应用效果，同时筛选出玉米秸秆青贮过程中产抗菌肽枯草芽孢杆菌和纤维素酶的最适添加剂量，为这2种添加剂在玉米秸秆青贮中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为收获籽实后的青贮玉米品种“渝青386”的玉米秸秆，其常规营养成分含量见表1。纤维素酶由上海某生物科技有限公司提供，活性为50 000 U/g；产抗菌肽枯草芽孢杆菌由甘肃某生物科技有限公司提供，活菌数≥1×108CFU/g。

表1 玉米秸秆常规营养成分含量

1.2 试验设计

于2021年1月2日将玉米秸秆从河南科技大学动物科技学院实践教学基地刈割后带回实验室用铡草机粉碎至2～3 cm。然后以400 mL/kg的剂量添加蒸馏水对玉米秸秆的含水量进行调整。之后将产抗菌肽枯草芽孢杆菌、纤维素酶分别以玉米秸秆鲜重0.01%、0.02%、0.03%的添加剂量溶于30 mL蒸馏水中。并分别添加到粉碎后的玉米秸秆原料中，空白对照组添加等量的蒸馏水。试验共计7个组，空白对照组命名为CK组，添加0.01%、0.02%、0.03%产抗菌肽枯草芽孢杆菌的3个组分别命名为0.01%BS组、0.02%BS组、0.03%BS组，添加0.01%、0.02%、0.03%纤维素酶的3个组分别命名为0.01%CL组、0.02%CL组、0.03%CL组，每个组设置3个重复。各组充分混匀后每个重复用四分法称取500 g玉米秸秆装入青贮袋中，充分压实后用热封机封口，常温避光保存110 d后开封检测。同时取3个重复(每个重复500 g)的玉米秸秆原料，带回实验室烘干粉碎检测玉米秸秆原料的营养组成。

1.3 试验方法

青贮完成后，每组取3个重复，每个重复取200 g玉米秸秆青贮置于牛皮纸袋中，于65 ℃烘箱中烘48 h，之后利用粉碎机粉碎过40目筛，置于自封袋中密封保存，用于常规营养成分含量的测定。DM、CP、粗脂肪(EE)和粗灰分(Ash)含量参照AOAC(2000)[12]的方法测定；NDF、ADF、酸性洗涤木质素(ADL)含量参照Van Soest等[13]的方法测定；水溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮法[14]测定；纤维素(CL)、半纤维素(HC)、综纤维素(HoC)含量通过公式计算得出。

各重复另称取20.00 g玉米秸秆青贮于250 mL三角瓶中，加入180 mL蒸馏水摇匀，置于4 ℃冰箱中浸提24 h，浸提后先用4层纱布过滤，再用2层滤纸过滤，得到浸提液。浸提液一部分用于pH测定，另取8 mL左右置于-20 ℃冷冻保存用于乳酸(LA)、氨态氮(NH3-N)和总氮(TN)含量的测定。其中，pH用pH计测定，LA含量采用对羟基联苯比色法[15]测定，NH3-N含量采用苯酚-次氯酸盐比色法[16]测定，TN含量采用凯氏定氮法测定。使用费氏评分(FS)对玉米秸秆青贮的发酵品质进行综合评定。

1.4 木质纤维组分、饲用价值及FS计算方法

CL、HC和HoC含量参照Ren等[17]的方法计算，计算公式如下：

CL=ADF-ADL；

1)

HC=NDF-ADF；

2)

HoC=CL+HC。

3)

生物降解潜力(BDP)参照Agneessens等[18]的方法计算，计算公式如下：

BDP=HoC/ADL。

4)

相对饲用价值(RFV)参照Rohweder等[19]的方法计算，计算公式为：

RFV=DMI(% BW)×DDM(% DM)/

1.29(以绵羊为动物基础)；

5)

DMI(% BW)=120/NDF(% DM)；

6)

DDM(% DM)=88.9-0.779×

ADF(% DM)。

7)

式中：DMI为粗饲料干物质采食量，单位为占体重的百分比即% BW；DDM为可消化的干物质，单位为占DM的百分比即% DM。

FS参照Wang等[20]的方法计算，计算公式如下：

FS=220+[2×DM(%)-15]-(40×pH)。

8)

1.5 综合评价

利用相关性分析和主成分分析将7个不同处理下的14个指标降维，简化评价指标数量，然后利用模糊数学隶属函数法计算各处理选择指标的隶属函数值，并将所选指标隶属函数值求和，之后取平均值，以平均值大小进行综合排名，平均值越大，排名越靠前。

隶属函数计算公式[21]如下：

R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

9)

R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

10)

式中：R(Xi)表示某指标的隶属函数值，Xi表示该指标的测定值；Xmax表示该指标的最大值；Xmin表示该指标的最小值。若测定指标与饲料品质呈正相关关系，则选择公式9)计算；若呈负相关关系，则选择公式10)计算。

1.6 数据处理与分析

试验数据先用Excel 2016进行初步整理，之后用SPSS 23.0统计分析软件进行主成分分析和单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较分析，结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同添加剂对玉米秸秆青贮常规营养成分含量的影响

由表2可知，0.03%CL组的DM含量显著高于CK组(P<0.05)；0.01%BS组的CP含量显著高于0.03%BS组(P<0.05)；0.02%CL组的Ash含量显著低于0.01%CL组、0.02%BS组和CK组(P<0.05)；CK组的WSC含量显著高于0.01%CL组、0.02%CL组和0.01%BS组(P<0.05)；EE含量在各组间均无显著差异(P>0.05)。

表2 不同添加剂对玉米秸秆青贮常规营养成分的影响

2.2 不同添加剂对玉米秸秆青贮木质纤维组分的影响

由表3可知，0.01%CL组和0.02%CL组的NDF和ADF含量均显著低于CK组(P<0.05)，0.02%CL组的ADF含量显著低于CK组和各BS添加组(P<0.05)；ADL含量表现为0.02%CL组显著低于其余各组(P<0.05)；0.01%CL组的纤维素含量显著低于CK组和0.03%BS组(P<0.05)；0.01%CL组的HC含量显著低于0.02%BS组(P<0.05)；HoC含量表现为0.01%CL组显著低于CK组和各BS添加组(P<0.05)。

表3 不同添加剂对玉米秸秆青贮木质纤维组分的影响(干物质基础)

2.3 不同添加剂对玉米秸秆青贮发酵品质的影响

由表4可知，0.03%BS组的pH显著低于0.01%BS组和0.01%CL组(P<0.05)；LA含量表现为0.01%BS组和0.03%BS组显著高于0.02%BS组和0.02%CL组(P<0.05)，CK组、0.01%CL组和0.03%CL组显著低于0.02%BS组和0.02%CL组(P<0.05)；FS表现为0.03%BS组和0.03%CL组显著高于0.01%BS组和0.01%CL组(P<0.05)；NH3-N/TN在各组间均无显著差异(P>0.05)。

表4 不同添加剂对玉米秸秆青贮发酵品质的影响(干物质基础)

2.4 不同添加剂对玉米秸秆青贮RFV和BDP的影响

由图1可知，0.01%CL组和0.02%CL组的RFV显著高于CK组和各BS添加组(P<0.05)；BDP则表现为0.01%BS组、0.02%BS组、0.01%CL组、0.03%CL组和CK组均显著低于0.02%CL组(P<0.05)。

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

2.5 不同添加剂处理的玉米秸秆青贮的主成分分析

对7个组的玉米秸秆青贮主成分分析结果见表5。基于特征值>1的标准挑选出4个主成分。其中，第1主成分的特征值为5.485，贡献率为39.181%，其对应特征向量中绝对值较大的指标为NDF、ADF、CL、HoC和ADL含量；第2主成分的特征值为3.406，贡献率为24.330%，其对应特征向量中绝对值较大的指标为NH3-N/TN、WSC和LA含量；第3主成分的特征值为2.931，贡献率为20.934%，其对应特征向量中绝对值较大的指标为pH、ADL和EE含量；第4主成分的特征值为1.149，贡献率为8.207%，其对应特征向量中绝对值较大的指标为DM、HC、EE和CP含量。这4个主成分的累积贡献率达到了92.652%，即保留了原有指标92.652%的信息。

表5 不同添加剂处理的玉米秸秆青贮的主成分分析

2.6 玉米秸秆青贮指标间的相关性分析

由图2可知，WSC含量与NH3-N/TN呈显著正相关(P<0.05)，与CP含量呈显著负相关(P<0.05)，相关系数分别为0.755、0.821；Ash含量与ADL含量呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数为0.957；NDF含量与ADF和HoC含量呈极显著正相关(P<0.01)，与CL含量呈显著正相关(P<0.05)，相关系数分别为0.955、0.889、0.856；ADF含量与CL和HoC含量均呈显著正相关(P<0.05)，相关系数分别为0.839、0.774；HC含量与HoC含量呈显著正相关(P<0.05)，相关系数为0.761；CL含量与HoC含量呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数为0.938；其余各指标间无显著相关性(P>0.05)。

“*”表示相关性达显著水平(P<0.05)；“**”表示相关性达极显著水平(P<0.01)。

2.7 各指标综合得分及其排名

综合主成分分析及相关性分析的结果，在挑选出的4个主成分中分别选择DM、CP、EE、LA、NH3-N/TN、pH、NDF、ADF这8个指标来代替其余指标进行模糊隶属函数分析并进行排名，结果如表6所示。0.02%CL组排名第一，平均隶属值为0.72；其次是0.03%CL组和0.01%BS组，平均隶属值分别为0.62、0.50，其综合评分均≥0.50；其余各组表现较差，其平均隶属值均<0.50。此外，各添加剂组的平均隶属值均大于CK组。

表6 各指标综合得分及其排名

3 讨 论

3.1 不同添加剂对玉米秸秆青贮常规营养成分含量的影响

DM含量是青贮饲料保存率的重要评定指标。本试验中，除CK组和0.01%BS组青贮过后DM含量小于30%以外，其余各组DM含量均在Khan等[22]推荐的范围(30%～35%)内。此外，0.03%CL组的DM含量显著高于CK组，这可能是纤维素酶的使用将植物细胞壁中的CL分解为HC、多糖及单糖等物质，为微生物的活动提供了充足的发酵底物，促进了发酵进程，从而降低了DM损失[23]。CP含量是反映青贮饲料营养价值的重要指标，WSC则是青贮过程中重要的微生物发酵底物，一般认为，WSC含量>5% DM才能满足发酵过程中微生物的需求，从而保证发酵质量[24]。本试验中，玉米秸秆原料的WSC含量为10.30%，满足以上要求。发酵过后，0.01%BS组的CP含量显著高于0.03%BS组，WSC含量显著低于CK组，这与Bai等[10]在紫花苜蓿青贮中添加产抗菌肽枯草芽孢杆菌所得试验结果一致。研究表明，芽孢杆菌属细菌能产生杆菌素、分歧杆菌素和真菌抑素等多肽和抗真菌化合物，其中真菌抑素能够抑制酵母菌和丝状真菌的生长，从而防止青贮变质[25]。因此，本试验中0.01%BS组的CP含量较高可能是由于产抗菌肽枯草芽孢杆菌产生了抗菌肽和真菌抑素，从而抑制了不良微生物的活动，促进了乳酸菌的生长繁殖，从而消耗大量的WSC，使CP得到有效保存；也可能是由于青贮过程中DM有一定损失，但CP基本保持不变，从而使得青贮过后CP的含量相对增加。但本试验中，0.03%BS组的CP含量较低，WSC含量较高，这有可能与产抗菌肽枯草芽孢杆菌的添加剂量有关。当产抗菌肽枯草芽孢杆菌的添加剂量较高时，在发酵初期可能与乳酸菌形成了竞争关系，消耗了大量的营养物质，从而不仅使整个发酵过程延缓，也造成了更多的CP被降解。此外，本试验中0.02%BS组的EE含量降低，但不存在显著性差异。这可能是由于该组的DM、CP、Ash和WSC含量均较高，从而使EE含量相对降低，具体原因有待进一步深究。

3.2 不同添加剂对玉米秸秆青贮木质纤维组分的影响

木质纤维组分主要包括NDF、ADF、ADL、CL、HC和HoC，这些都是影响饲粮消化降解的重要因素，其中NDF、ADF、ADL与饲粮的瘤胃降解率呈现一定的负相关关系[26]。本试验中，青贮过后各组的NDF和ADF含量均有一定程度降低，这与那亚等[27]对全株玉米青贮的研究结果一致，说明青贮是改善植物性粗饲料木质纤维组分的有效方法。0.01%CL组和0.02%CL组的NDF含量显著低于CK组和各BS添加组，0.02%CL组的ADF含量显著低于CK组和各BS添加组。Li等[28]研究了纤维素酶在王草青贮中的添加效果，万江春等[29]研究了纤维素酶在棉花秸秆青贮中的添加效果，均发现纤维素酶的使用能够降低NDF和ADF的含量，这与本试验结果一致。这说明纤维素酶对于NDF和ADF具有较高的降解能力，同时也说明在这2种添加剂量下纤维素酶的作用效果更好。此外，各BS添加组的ADF含量虽与CK组没有显著差异，但仍表现出下降趋势。这可能是产抗菌肽枯草芽孢杆菌的添加能够加快发酵进程，促进LA等有机酸的产生，从而在强酸环境下使ADF等结构性碳水化合物产生了分解现象[30]。ADL是影响CL和HC等木质纤维降解的主要屏障，高含量的ADL会降低粗饲料的生物降解率[26]。本试验中，0.02%CL组的ADL含量显著低于其余各组。寇江涛等[31]研究发现，在水稻秸秆和白酒糟混合青贮中添加纤维素酶能显著降低ADL的含量。王亚芳等[32]研究表明，在全株玉米青贮中添加纤维素酶后ADL含量具有降低的趋势。这与本试验结果一致。研究表明，一些微生物区系或其代谢产物能够破坏ADL的复杂结构[33]。因此，本文推断0.02%纤维素酶的添加可能与某种具有降解ADL功能的微生物存在一定的协同效应，从而促进ADL降解。RFV是用于预测牧草的摄入量和能量的评定指标，由可消化的干物质(DDM)和干物质采食量(DMI)计算得出，NDF含量与DMI呈负相关关系，ADF含量与DDM呈负相关关系，因此RFV是粗饲料中NDF和ADF含量的综合反映[34-35]。本试验中，0.01%CL组和0.02%CL组的RFV显著高于CK组和各BS添加组，这与其具有较低的NDF和ADF含量直接相关。BDP是衡量青贮饲料可降解特性的指标[36]，其与ADL含量成反比例关系。本试验中，由于0.02%CL组含有最低的ADL，因此其BDP也最高，也说明其具有最好的生物质降解能力。

3.3 不同添加剂对玉米秸秆青贮发酵品质的影响

衡量青贮饲料发酵品质的主要指标有pH、LA含量和NH3-N/TN。一般认为，优质的青贮饲料pH<4.2，LA含量在4%～6%，NH3-N/TN<10%[37-39]。本试验中，所有组别的玉米秸秆青贮pH均在4.2以下，说明发酵比较成功。0.03%BS组的pH显著低于0.01%BS组和0.01%CL组，0.01%BS组的LA含量最高。Lara等[9]研究发现，添加枯草芽孢杆菌会降低玉米青贮中的LA含量，这与本试验结果趋异。Cruz Ramos等[40]报道，枯草芽孢杆菌能在厌氧条件下通过丙酮酸还原产生LA。这可能是本试验中0.01%BS组LA含量最高的原因。也有可能是因为BS的添加促进了玉米秸秆青贮中同型乳酸菌的大量繁殖，从而产生了更多的LA。此外，本试验中0.02%CL组的LA含量也显著高于CK组，这与赵金鹏等[30]在水稻秸秆中添加纤维素酶的效果相似，可能是由于在这个纤维素酶添加剂量下，饲粮中的CL等结构性碳水化合物能够最大程度地被降解，从而使得可溶性糖被释放出来，为乳酸菌的发酵提供了额外的发酵底物，从而产生更多LA[41]。NH3-N/TN代表了青贮饲料中蛋白质的降解程度，FS则综合反映了青贮饲料的DM含量和pH[19]。在发酵过程中，梭菌、大肠杆菌等不良微生物的存在会抑制乳酸菌生长，使得以乳酸菌为主导的厌氧发酵过程出现偏离，从而导致蛋白质降解为NH3-N[42]。本试验中，所有组别的NH3-N/TN均在10%以下，属于较好的范围。虽然各组别的NH3-N/TN无显著差异，但所有添加剂组的NH3-N/TN相比于CK组仍有小幅度降低，说明这2种添加剂的使用能够在一定程度上提高蛋白质的保存率。本试验中，0.03%BS组和0.03%CL组的FS显著高于0.01%BS组和0.01%CL组，这主要是与0.03%BS组和0.03%CL组具有较高的DM含量和较低的pH有关。

3.4 主成分分析及隶属函数分析综合评定玉米秸秆青贮品质

主成分分析是指将多个指标减少为包含80%以上所有信息的几个综合指标，然后对综合指标进行分析[43]。隶属函数分析是一种基于通过多指标测定、分析，进而对事物特征进行综合评价的评估法[44]。目前，畜牧业饲料研究中已经广泛应用主成分分析和隶属函数分析对测定指标进行综合评定[45]。本试验中，将7个组的14个指标综合为4个独立因子，反映了92.652%的原始变量信息，能够较为全面地对测定指标进行概括。其中，第1主成分贡献率(39.181%)最大，其对应特征向量中绝对值较大的指标为NDF、ADF、CL、HoC和ADL含量等木质纤维组分，说明木质纤维组分是评价玉米秸秆青贮质量的重要指标。此外，本试验对降维处理后的8个指标进行隶属函数评价，结果显示，0.02%CL组、0.03%CL组和0.01%BS组青贮质量较好，其隶属函数值分别达到了0.72、0.62和0.50，其综合评分均≥0.50。其中0.02%CL组得分最高，这不仅说明了纤维素酶对木质纤维组分具有较高的降解能力，同时也侧面反映了主成分分析和隶属函数评价法在综合评定方面的准确性，避免了利用单一指标评定玉米秸秆青贮品质的片面性。

4 结 论

产抗菌肽枯草芽孢杆菌和纤维素酶对玉米秸秆青贮的常规营养成分含量和发酵品质均有一定程度的提升效果。通过主成分分析和隶属函数分析综合评价表明，各添加剂组的平均隶属值均大于CK组，其中产抗菌肽枯草芽孢杆菌以0.01%的添加剂量效果最好，纤维素酶以0.02%的添加剂量效果最好。所有组别中以0.02%CL组得分最高，建议在实际生产中使用0.02%纤维素酶。