兰州百合和大花卷丹远缘杂交胚挽救技术研究

尹燕 杨道兰 冯炜弘 牛慧婷 李爱兵 何潇 王璐

摘要：利用兰州百合与大花卷丹进行正反交，研究了花期调控、不同授粉方式、蒴果采收时间及胚挽救培养基配方对杂种胚萌发率及成苗率的影响。结果表明，兰州百合延后种植及大花卷丹提前种植，可有效地解决花期不遇的问题;兰州百合与大花卷丹杂交授粉时，花期授粉的蒴果膨大率可达93.3%，种子有胚率为2.00%;大花卷丹与兰州百合杂交授粉时，切割柱头的授粉膨大率最高，仅为7.6%，但种子有胚率为0%。兰州百合与大花卷丹杂交授粉后60～70 d的蒴果进行胚培养较为适宜。兰州百合与大花卷丹的杂交胚适宜培养基为MS+0.3 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA。

关键词：兰州百合;大花卷丹;远缘杂交;胚挽救

中图分类号：S644.1            文献标志码：A            文章编号：1001-1463（2022）04-0029-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.04.006

Study on the Embryo Rescue Techniques of the Distant Hybrids of Lilium davidii var. unicolor and Lilium leichtlinii var. maximowiczii

YIN Yan， YANG Daolan， FENG Weihong， NIU Huiting， LI Aibing， HE Xiao，WANG Lu

（Lanzhou Agricultural Science and Technology Research Extension Center， Lanzhou Gansu 730000， China）

Abstract：The effects of flowering regulation， different pollination methods， capsule harvesting time and embryo rescue medium formula on the germination rate and seedling rate of hybrid embryos were studied by positive and negative cross between Lilium davidii var. unicolor and Lilium leichtlinii var. maximowiczii. The results showed that delayed planting at different time points of low temperature storage during cold storage of Lilium davidii var. unicolor and early planting protection measures of Lilium leichtlinii var. maximowiczii could effectively resolve the problem of flowering; Flowering pollination can be used in hybrid pollination of Lilium davidii var. unicolor × Lilium leichtlinii var. maximowiczii， capsule expansion rate can reach 93.3%， the embryo rate of seeds  was 20‰; while Lilium leichtlinii var. maximowiczii hybrided with Lilium davidii var. unicolor， the expansion rate of cutting stigma pollination was the highest， only 7.6%， but the embryo rate of seeds was 0%; It was more suitable for embryo culture of capsules 60 d～70 d after pollination by Lilium davidii var. unicolor × Lilium leichtlinii var. maximowiczii; the optimum medium for the hybrid embryos of Lilium davidii var. unicolor hybirded with Lilium leichtlinii var. maximowiczii was MS+0.3 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA.

Key words：Lilium davidii var. unicolor;Lilium leichtlinii var. maximowiczii;Distant hybridization;Embryo rescue

蘭州百合（Lilium davidii var. unicolor）作为我国三大主栽食用品种[龙牙百合（Lilium brownie var.viridulum Baker）、 宜兴百合（Lilium lancifolium Thunb）、兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）]之一 [1- 2 ]，因其较高的含糖量、独特的风味 [3 - 4 ]，成为了食用百合中的佼佼者。随着兰州百合产业近些年来的向好发展[5 ]，一些突出问题也已显现，主要表现在产量低、品种退化严重、千字头多、黄化现象严重等方面[6 - 8 ]，要从根本上解决这些问题，还需要源源不断地选育新品种。耿兴敏等[9 ]研究了兰州百合/大花卷丹、大花卷丹/兰州百合采用延迟授粉和切割柱头授粉的有胚率和萌发率，但未对杂交后代进行胚挽救技术研究。我们选用兰州百合和长势强、产量高的药食两用的大花卷丹为研究材料，通过花期调控、不同的授粉方式、蒴果采收时间及胚挽救培养基优化，以期探索一套可行的胚挽救技术，为食用百合的远缘杂交提供技术支撑。

1   材料与方法

1.1   试验材料

供试的兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）和大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowiczii），均种植在兰州市榆中县新营乡百合种质资源基地。

1.2   试验方法

1.2.1   百合花期调控   2018年及2019年的种植试验表明，当年4月15日种植兰州百合和大花卷丹，兰州百合的花期一般在7月1 — 15日，大花卷丹的花期一般在7月15 日至 8月15日，百合杂交授粉时2种百合花期无法相遇。因此采用兰州百合冷库低温贮存延后种植及大花卷丹保护措施提前种植方法，具体方法见表1。

1.2.2    百合杂交授粉方法比较    参照李润根[10 ]的方法并作部分修改。采用花期授粉、蕾期授粉、切割柱头授粉[11 ]、混合蒙导授粉4种方法进行授粉。开花前1 d将杂交母本去雄，随后立即用锡箔纸将母本的柱头进行包裹，以免受到其他植株花粉的干扰。授粉时间选取在当天开花的8：00 — 12：00时，待母本的柱头有大量粘液分泌时，将杂交父本当天开放的花粉授予母本柱头上，随后继续用锡箔纸将其母本的柱头包裹。授粉20 d后统计杂交蒴果膨大率，蒴果膨大情况参照李婕等[12 ]的方法并作修改，如表2所示。当蒴果皮开始变黄时，统计有胚率。

蒴果膨大率=[（C2+C3+C4）/授粉花朵数]×100%

有胚率=（有胚种子数/总种子数）×100%

1.2.3    蒴果不同采收时间对杂交胚萌发的影响

百合杂交授粉的试验结果表明，大花卷丹与兰州百合杂交授粉的种子有胚率为0，因此选用兰州百合与大花卷丹杂交后的蒴果。在兰州百合与大花卷丹杂交授粉后30、40、50、60、70 d各采收蒴果30个，采用子房分段培养的方法[13 ]，将切段子房接种在MS+0.2 mg/L NAA+0.6 mg/L 6-BA+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L，pH 5.8培养基上。150 d后调查胚萌发率，并将已萌发的胚珠继续接种在MS+ 0.2 mg/L NAA+0.6 mg/L 6-BA+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L，pH 5.8培养基，培养60 d后统计成苗率。

萌发率=（萌发的个数/接种胚珠数）×100%（统计得到每个膨大蒴果内胚珠个数平均为300个）

成苗率=（成苗的个数/接种胚珠数）×100%

1.2.4    不同激素配比对杂交胚萌发的影响     摘取授粉60 d的兰州百合与大花卷丹的杂交蒴果，采用子房分段培养的方法[13 ]，将切段子房接种在添加不同配比NAA与6-BA的MS培养基上，NAA浓度设置为0.1、0.3、0.5 mg/L，6-BA浓度设置为0.2、0.4、0.8 mg/L。150 d后调查胚的萌发率，将已萌发的胚珠继续接种在最适的胚萌发培养基上，60 d统计成苗率。胚萌发率及成苗率计算方法同1.2.3。

1.2.5    数据统计分析    试验数据采用Excel 2007与SPSS 7.0软件分析。

2   结果与分析

2.1   百合花期調控技术评价

由表3可以看出， 4月15日、5月1日、5月15日3个不同时间节点种植兰州百合，可保证在7月1日至8月15日均有兰州百合开花; 4月1日、4月15日2个时间点种植大花卷丹，可使大花卷丹在7月1日至8月15日均可开花。因此，兰州百合冷库低温贮存不同时间点延后种植及大花卷丹保护措施提前种植，可有效地解决花期不遇的难点，可从源头上保障杂交授粉的可行性。

2.2   不同授粉方式对百合杂交结实率的影响

由表4可知， 各种授粉方式均能使兰州百合/大花卷丹、大花卷丹/兰州百合杂交蒴果膨大，但子房膨大率存在较大差别。兰州百合与大花卷丹杂交授粉的子房膨大率为82.6%～94.5%，而大花卷丹与兰州百合杂交授粉膨大率仅为4.4%～7.5%。

兰州百合/大花卷丹无论采用哪种授粉方式，子房膨大率均在82.6%以上，种子有胚率均在2.00%左右。其中子房膨大率以切割柱头授粉最高，达到了94.5%;蕾期授粉最低，为82.6%。子房膨大率各处理间差异显著。各处理的种子有胚率从小到大依次为切割柱头、花期授粉、蕾期授粉和混合萌导授粉，但花期授粉、蕾期授粉、混合萌导授粉差异不显著，从授粉的便利性考虑，可选择花期授粉。

2.3   蒴果不同采收时间对杂种胚萌发的影响

由图1可知，随着蒴果采收时间的延后，胚萌发率及成苗率均有提高，授粉后70 d采收的蒴果，经培养后的胚萌发率及成苗率均达到最高，分别为1.356%和1.267%，授粉后60 d采收的蒴果经培养后萌发率及成苗率与授粉后70 d差别不大。经试验观察，授粉70 d之后蒴果已经干枯，种子含水量较低，子房切片时不宜操作，故选择授粉后60～70 d的杂交蒴果进行胚培养较为适宜。

2.4   不同激素配比对杂交胚萌发的影响

由表5可知，兰州百合与大花卷丹杂交胚在不同激素配比的MS 培养基上萌发率和成苗率有较大差异。NAA浓度为0.3 mg/L时，兰州百合与大花卷丹杂交胚的萌发率及成苗率要高于NAA其他浓度。当NAA浓度一致、6-BA 浓度为0.8 mg/L时，兰州百合与大花卷丹杂交胚的萌发率及成苗率低于其他2个6-BA 浓度。当NAA浓度为0.3 mg/L，6-BA 浓度为0.2 mg/L时，胚萌发率及成苗率均达到了最大。可见，兰州百合与大花卷丹杂交胚的适宜培养基为MS+0.3 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA。

3   小结

通过兰州百合冷库低温贮存不同时间点延后种植及大花卷丹保护措施提前种植，可有效地解决花期不遇的难点，从而从源头上保障了杂交授粉的可行性。兰州百合与大花卷丹杂交授粉时，可采用花期授粉，蒴果膨大率可达93.3%，种子有胚率为2.00%;大花卷丹与兰州百合杂交授粉时，切割柱头授粉膨大率最高，为7.5%，但种子有胚率为0%;

从种子有胚率来看，兰州百合/大花卷丹组合无论哪种授粉方式，种子有胚率均在2.00%左右，而大花卷丹/兰州百合组合的种子有胚率均为0。耿兴敏等[9 ]在研究野生百合组间杂交时也发现，大花卷丹与兰州百合杂交种子有胚率为0，兰州百合与大花卷丹通过延迟授粉种子有胚率为2.4%，与本研究基本相一致。耿兴敏等[9 ]研究发现，大花卷丹/兰州百合通过延迟授粉，子房膨大率可达80%，切割柱头授粉的子房膨大率为50%;兰州百合/大花卷丹通过延迟授粉，子房膨大率为92.5%，而切割柱头未观察到子房膨大现象。上述结果与本研究结果相差较大，原因可能是與授粉方式与授粉时间有关。

采用兰州百合与大花卷丹杂交授粉后60～70 d的蒴果进行胚培养较为适宜。雷家军等[14 ]在研究百合种间杂种胚培养时，发现50 d蒴果虽已干枯，但萌发率及成苗率仍然较高，与本实验结果一致。

兰州百合与大花卷丹的杂交胚适宜培养基为MS+0.3 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA。

参考文献：

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收稿日期：2021 - 12 - 30

基金项目：兰州市人才创新创业项目（2020-RC-144）;陇原青年创新创业人才项目（2022）。

作者简介：尹   燕（1983 — ），女，甘肃金昌人，农艺师，硕士，研究方向为种质资源选育与采后生物学。Email：544895391@qq.com 。

作者简介：杨道兰（1970 — ），女，甘肃皋兰人，农艺师， 研究方向为蔬菜育种。Email：875516380@qq.com。