基于实时质谱快速监控牦牛肉水煮过程中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸的生成

张聪，丛梦，傅小玲，黄琴，李伟丽，陈伍志，吴韬*

1(西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都，610039)2(四川红原溜溜牛食品有限责任公司，四川 阿坝藏族羌族自治州，624400)

美拉德反应是指还原糖类等羰基化合物和氨基化合物之间的反应，其除了会赋予食品独特的风味和诱人的色泽，还会产生糖基化终末产物(advanced glycation endproducts，AGEs)等有害物质[1]。AGEs 在食品中广泛存在并通过摄入的食品积累在体内，有研究表明食品中羧甲基赖氨酸[Nε-(carboxymethyl)lysine，CML]、羧乙基赖氨酸[Nε-(carboxyethyl)lysine，CEL]是体内AGEs 的主要来源[2]，AGEs 的积累会使人体产生氧化应激反应，对糖尿病、肾病、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症等疾病的诱发有着重要影响[3]。相对于低 AGEs 含量的饮食，摄取 AGEs 含量较高的食物容易引起实验动物肾病的发生[4]。因此检测与限制调控食品中的AGEs对于保障食品安全具有重要意义。目前报道的检测方法主要为酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[5]、荧光检测法[6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[7]、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[8]。ELISA准确度低，多用于检测总的AGEs含量；荧光检测法则一般用于能够自发荧光的AGEs的检测；GC-MS需要在测试前将样品进行复杂的衍生化；LC-MS/MS则需要复杂的前处理，需要使用固相萃取小柱对AGEs进行净化[9]，单次进样需要进行长时间的色谱分离，费时费力。

实时直接分析质谱(direct analysis in real time mass spectrometry，DART-MS)是一种开放式离子化质谱技术[10], 其主要结构包括DART离子源、轨道式进样器及质谱(图1)。该技术优点在于，对样品前处理要求较低、不需要色谱分离，因此能够对样品进行高通量检测[11]。近年来，DART-MS已经广泛应用于食品领域[12]。本研究以水煮牦牛肉为研究模型，拟建立一种基于DART-MS/MS技术的CML和CEL高通量快速检测方法，并考察外源性抗氧化食品原料苦荞、藤椒对牦牛肉水煮过程中CML、CEL生成的影响。研究结果将为食品中CML和CEL高通量快速检测、开发高品质牦牛肉产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛肉，四川省溜溜牛食品有限公司；苦荞粉、藤椒粉，市售。

CML标准品(纯度98%，加拿大TRC公司)；芦丁标准品(纯度98%)，成都普瑞法科技开发有限公司；甲醇(色谱级)，上海易恩化学技术有限公司；正己烷、NaNO2、AlCl3·6H2O，成都市科隆化学品有限公司；高纯N2、高纯He，成都泰竽工业气体有限公司。

图1 DART-MS检测系统Fig.1 DART-MS determination system

1.2 仪器与设备

DART离子源，美国Ionsense公司；SCIEX 3500 三重四级杆质谱仪，美国AB SCIEX公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的制备

精确称取CML标准品，用甲醇溶解、稀释配制成质量浓度分别为50.0、30.0、20.0、10.0、5.0、1 μg/mL 的CML标准溶液[13-14]。

1.3.2 牦牛肉样品的准备

将50 g牦牛肉均匀切成1 cm3大小的块，加入200 mL冷水中进行煮制，煮制时分别加入牦牛肉质量0%(对照组)、10%、30%和50%的苦荞粉或藤椒粉，12 min后取出。每组3个平行。

1.3.3 牦牛肉中CML与CEL的提取

参考ZHANG等[15]和HEGELE等[16]的研究：取煮制后的牦牛肉5 g剁碎，将剁碎后的牦牛肉样品放于50 mL离心管中，加入20 mL预冷后的20 g/L三氯乙酸水溶液，除去蛋白沉淀。将上清液采用正己烷脱除油脂，将下清液置于真空离心浓缩机进行浓缩干燥，加入2 mL甲醇水溶液(体积比8∶2)复溶，经0.22 μm 微孔有机滤膜过滤后装入样品瓶中，备用。

1.3.4 苦荞、藤椒总黄酮的测定

根据REMIREZ等[17]的研究方法略作修改后测定苦荞粉和藤椒粉中的黄酮含量。结果以毫克芦丁当量每100g干物质(mg RE/100g DW)计。

1.3.5 质谱条件

DART SVP离子源条件：采用高纯He为工作气体；DART离子源与质谱仪距离2 cm，进样针移动速度为0.6 mm/s；进样体积1 μL。质谱条件：正离子扫描模式，去簇电压40 V，碰撞能量20 V。

1.4 计算方法

1.4.1 基质效应的计算

通过公式(1)计算牦牛肉样品中CML的基质效应。

(1)

1.5 数据处理

实验数据采用SPSS统计软件进行分析，使用GraphPad Prism 8进行绘图。

2 结果与分析

2.1 CML和CEL的二级质谱裂解行为及定量离子对选择

预试验表明，CML、CEL均在正离子模式下才有信号，因此，本研究均采用质谱正离子模式进行测试。为了降低CML、CEL的检出限，需要对CML、CEL二级质谱裂解行为进行研究，选择合适的定量检测离子对[多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)]。对牦牛肉样品中CML、CEL分别进行二级质谱扫描，其二级质谱图见图2。

a-CML二级质谱图；b-CEL二级质谱图图2 牦牛肉样品中CML、CEL的二级质谱图Fig.2 DART-MS/MS fragments of CML and CEL

由于CML与CEL仅仅相差1个—CH2结构，其二级质谱裂解规律非常类似。本文仅以CML的二级质谱裂解规律为例进行解析。如图2和图3所示，CML的分子离子峰为m/z205。碎片m/z130是m/z205经历氢重排后，脱去1个氨基乙酸基团形成的；碎片m/z84是由m/z130脱去1个—HCOOH形成；m/z142 是由m/z205依次脱去—H2O、—CO，电子迁移形成双键后脱去—NH3形成。由于碎片m/z130为最强信号峰，因此CML选择205～130为定量离子对，CEL选择219～130为定量离子对。

图3 样品中CML二级质谱裂解规律Fig.3 DART-MS/MS cracking law of CML

2.2 DART-MS条件优化

在DART-MS测试样品的过程中，解析气体的温度会显著影响待测样品组分的电离效率[18]。因此，本研究考察了解析气体的温度对CML一级母离子(m/z205)响应强度的影响。如图4-a所示，随着气体温度从 300 ℃逐渐升至 450 ℃时，CML响应强度逐渐升高；当温度升至 500 ℃时，CML的响应强度开始下降。因此，选用450 ℃为解析气体的最优温度。

栅网电极电压能够减少空气中的杂质离子，可以减少质谱图上的背景干扰[19]。本研究考察了100～300 V的栅网电极电压对待测组分响应强度的影响。如图4-b所示，CML的响应强度在150 V时信号强度最大，随后CML母离子响应强度逐渐降低。因此，选择150 V为最优的栅网电极电压。

去簇电压的大小会显著影响CML(m/z205)母离子的响应强度。本实验考察了10～50 V 去簇电压对m/z205离子响应强度。如图4-c所示，随着去簇电压的增加，CML的响应强度先增大后减小，当去簇电压为40 V时，CML母离子峰的响应强度最高。因此，选择40 V为实验的去簇电压。

质谱的碰撞能量也能显著影响CML(m/z205)二级碎片离子的信号强度。因此，选择合适的碰撞能量值对目标物的定量分析有着十分关键的作用。本研究采用m/z130作为CML的定量离子，以二级碎片离子m/z130的响应强度作为指标对碰撞能量值进行优化。如图4-d所示，随着CE值的增大，m/z130的响应强度先增大后减小；相较于碰撞能量值为15 V时，碰撞能量值为20 V时，二级碎片离子的峰形更佳，且母离子碎裂更加充分，综合考虑，选择20 V作为CML定量分析的碰撞能量。

a-温度；b-栅网电极电压；c-去簇电压；d-碰撞能量图4 基于DART-MS测定CML的测试条件优化Fig.4 Optimization of test conditions for CML determination based on DART-MS

采用优化好的质谱条件对CML标准品进行测试，采用MRM模式，以m/z205～m/z130作为定量离子对，如图5所示，在2 min内即可完成8次平行样品的测定。由于CML与CEL属于同系物，其理化性质非常相近，采用传统超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)方法检测，色谱分离需要 10 min以上，而 DART-MS/MS方法无色谱分离过程，在常压下能够直接进样，可以大幅缩短分析时长。

图5 CML 8次平行进样的总离子流图Fig.5 Total ion chromatography diagram of eight parallel injections of CML

2.3 方法学验证

2.3.1 线性方程、相关系数、检出限(detection limit，LOD)及定量限(quantification limit，LOQ)

如图6所示，以峰面积为纵坐标，CML质量浓度为横坐标进行线性回归分析，得到标准曲线和相关系数R2。CML在 1～50 μg/mL，R2为0.996 3，表明线性关系良好。LOD为0.1 μg/g，LOQ为0.5 μg/g。这表明本方法能有效地对CML进行检测，具有良好的灵敏度。

图6 CML标准曲线Fig.6 Standard curve of CML by DART-MS

2.3.2 基质效应

基质效应是指样品中除目标组分以外的组分在电离过程中，对目标成分可能产生离子增强或者抑制效应[20]。基质效应在定量分析中可能会严重影响待测物的精密度和准确性，因此需要研究 DART-MS 方法测定CML的基质效应。

由于缺少商业化的空白基质(不含CML的牦牛肉)，因此本研究采用自由态AGEs的提取液直接溶解CML标准品，然后使用样品提取溶液对其进行连续稀释。最终牦牛肉中CML加标质量浓度为8.17～53.17 μg/mL，具体见表1。

表1 方法的线性参数、基质效应、检出限及定量限Table 1 Linear parameters，matrix effect，detection limit and quantification limit of the method

当|基质效应|≤ 20 时，可以认为基质效应较弱[21]。由表1可知，牦牛肉中CML的基质效应为-15.63%，表明牦牛肉中的基质对CML含量有轻微抑制作用，但是影响不显著，可以直接采用CML的标准曲线进行定量分析。

2.3.3 回收率与精密度

在样品中添加50、20、5 μg/g 3个质量分数的目标分析物(表2)，每个添加量平行测定5次，分别测定加标回收率和精密度。精密度用相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示。结果如表2所示，整体上CML的平均回收率为100.77%～117.36%，RSD为8.22%～9.87%。因此，DART-MS 方法的准确性和稳定性较好，可用于快速检测样品中CML的含量。

表2 方法的加标回收率与精密度(n=5)Table 2 Results of standard recovery rate and precision of the method

2.3.4 苦荞和藤椒对牦牛肉中CML、CEL生成的影响

苦荞和藤椒中含有多种黄酮类物质，具有较强的抗氧化活性，总黄酮含量与抗氧化活性成正相关。本文采用的苦荞粉中总黄酮含量为142.23 mg RE/100g DW，藤椒中总黄酮含量604.86 mg RE/100g DW。由于CML与CEL结构近似，采用上述建立的 DART-MS/MS快检方法对牦牛肉样品中的CEL含量进行估测(以CML计)。实验结果如图7所示，加入苦荞粉煮制后的牦牛肉中的CML和CEL含量逐渐降低，对比空白样，添加牦牛肉质量50%的苦荞粉煮制后，样品中CML含量降低7.72%，CEL含量下降1.46%，具有显著性差异；而加入牦牛肉质量50%藤椒粉煮制后的牦牛肉CML含量相较于空白样品降低了14.51%，CEL含量却增加7.35%，差异极显著，这可能是由于藤椒中富含苏氨酸，在AGEs生成过程中参与了CEL前体物质丙酮醛的生成，导致CEL含量增多。前人研究也发现，在蛋白质糖化早期，木犀草素等黄酮成分能够抑制AGEs形成[22]。苦荞、花椒中均含有多种黄酮类物质[23-24]，这可能是加入苦荞粉后牦牛肉中CML、CEL均显著下降的原因。

a-苦荞粉添加量；b-藤椒粉添加量图7 苦荞粉、藤椒粉添加量对AGEs的影响Fig.7 Effect of tartary buckwheat and zanthoxylum schinifolium powder on AGEs 注：ns表示无显著差异(P>0.05)；*表示差异显著(P<0.05)； **表示差异极显著(P<0.01)

3 结论

与UPLC-MS/MS方法相比，DART-MS方法操作简单，结果准确，单次样品测定时间小于30 s，能大幅缩短分析时长，并且不使用流动相，具有环保的优点。消减工艺研究结果表明，苦荞可以同时有效减少牦牛肉在煮制过程中CML和CEL的生成；藤椒能有效减少牦牛肉在煮制过程中CML含量，但却增加了CEL含量，其具体机制有待进一步研究。