一种快速分析聚山梨酯80组分的方法

周 颖，赵 恂，胡 楠，王保成，袁耀佐

（1南京中医药大学药学院，南京 210023；2江苏省食品药品监督检验研究院，南京 210019；3国家药品监督管理局化学药品杂质谱研究重点实验室，南京 210019；4安捷伦科技（中国）有限公司，北京 100102；5南京威尔药业集团股份有限公司，南京 210009）

聚山梨酯80（polysorbate 80，PS80），商品名为吐温80，化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，结构见图1。该结构以失水山梨醇为母核，在4 个羟基端聚合了一定数目的环氧乙烷单体，形成了4个聚氧乙烯（PEG）侧链，其中1 个侧链的羟基端连接了一分子油酸（含有1个不饱和双键的十八碳脂肪酸）。结合油酸酯的聚氧乙烯侧链为疏水基团，未结合的侧链为亲水基团，这性质使其是一个两亲性的非离子表面活性剂［1-3］。因此在药物制剂中，PS80常用来促进难溶性药物的溶解，提高乳剂的稳定性，并在生物制剂中防止蛋白分子在液-瓶与液-气界面聚集和变性［4-6］。

Figure 1 Structure of polysorbate 80

在工业上，合成PS80主要有两种方法：一是先酯后醚，二是先醚后酯［7］。从这两种方法的合成过程可知，由于山梨醇失水过程不可控，PS80母核中会存在山梨醇、一失水山梨醇、异山梨醇以及分子间失水物等失水山梨醇结构；其次，环氧乙烷聚合后产物呈正态分布，在其母核中存在一系列不同聚合度n的聚醚结构；此外，由于原料油酸纯度不一，PS80 结构上结合的脂肪酸酯也不单单是油酸酯，按照《中华人民共和国药典》（2020 年版）四部规定［8］，PS80 的脂肪酸组成中含油酸应不低于58.0%，含肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸与亚麻酸分别不得过5.0%、16.0%、8.0%、6.0%、18.0%与4.0%，所以PS80 是一种具有复杂组分的混合物。查阅现有的国内外文献发现［9-11］，理论上PS80 可能是由11 大类化合物组成，包括聚氧乙烯山梨醇酐（polyoxyethylene sorbitan，PS）、聚氧乙烯山梨醇酐一油酸酯（polyoxyethylene sorbi‑tan monoleate，PSM）、聚氧乙烯山梨醇酐二油酸酯（polyoxyethylene sorbitan dioleate，PSD）、聚氧乙烯山梨醇酐三油酸酯（polyoxyethylene sorbitan triole‑ate，PSTri）、聚氧乙烯山梨醇酐四油酸酯（polyoxy‑ethylene sorbitan tetraoleate，PSTetra）、聚氧乙烯异山梨醇酐（polyoxyethylene isosorbitan，PI）、聚氧乙烯异山梨醇酐一油酸酯（polyoxyethylene isosorbi‑tan monoleate，PIM）、聚氧乙烯异山梨醇酐二油酸酯（polyoxyethylene isosorbitan dioleate，PID）、聚氧乙烯（polyethylene glycol，PEG）、聚氧乙烯一油酸酯（polyoxyethylene monoleate，PM）和聚氧乙烯二油酸酯（polyoxyethylene dioleate，PD）。

但是有研究发现，PS80 中含有的PIM 组分具有强烈的致肥大细胞脱颗粒的作用［12］，并且以异山梨醇酐为母核的组分细胞溶血率很高［13-14］。由此可见，PS80 引起的不良反应可能与其复杂的组分有关，因此，这就需要利用先进技术对其组分进行检测分析，以此全面地了解PS80，以期为安全用药提供参考。

现今，用于表征PS80组分的方法手段有很多，例如高效液相色谱结合蒸发光散射检测器（HPLCELSD）［11，15-18］、高效液相色谱结合电喷雾检测器（HPLC-CAD）［19］、高分辨质谱（HRMS）［20］、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）［9］、超临界流体色谱-飞行时间质谱联用（SFCQTOF-MS）［21］、核磁共振波谱（NMR）［22］、超高效液相色谱-高分辨质谱-核磁共振波谱联用（UHPLCHRMS-NMR）［10，23］等。其中UHPLC-HRMS 方法因方便快速，常被研究者采用，但是，对PS80 复杂组分的快速解析测定仍存在很大的困难，为此，有研究者开发了ExcipientProfiler 药用辅料智能分析系统，专门用于解析聚山梨酯系列辅料的质谱信息［10］，该软件依据聚山梨酯系列化合物保留时间与结构间关系的原理，为每个组分亚类建立了预测模型，随后通过导入相关质谱数据，即可自动分析，方便快速地对每一组分中每一种聚合物单体进行定性。故本研究将采用UHPLC-HRMS 对3 家企业共10 批PS80 进行测定，然后利用Excipient‑Profiler 软件对测定数据进行解析，并采用与该软件中PS80 库相同原理构建的扩展数据库进行补充，希望简单快速了解PS80的组分，以此来对采用不同工艺生产的市售PS80 进行区分，为其应用提供更好的分析方法。

1 材 料

1.1 试 剂

聚山梨酯80（南京威尔药业集团股份有限公司提供，A1批号20210304-1、A2批号20190405、A3批 号20210401、A4 批 号20180606、A5 批 号20190527；上海卡乐康包衣技术有限公司提供，B1批 号2020020001、B2 批 号2020040002、B3 批 号2020110003；赛诺菲制药有限公司提供，C1 批号AA00144-55641、C2 批号CA01016-63296，除A1 和A2 为注射级，其余均为普通级。其中南京威尔药业的样品合成过程为先醚后酯［7］，其余未知。）

甲酸（FA，美国ACS 恩科化学）、乙腈（ACN，德国默克公司）均为质谱级；无水乙酸钠（色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司）；实验用水为屈臣氏饮用水。

1.2 仪器、软件及数据库

超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪：Agilent 1290 超 高 效液 相 色 谱、Agilent 6546 Q-TOF 质 谱（美国安捷伦公司）；IKA MS 3 Digital 涡旋混匀器（德国艾卡公司）。ExcipientProfiler 药用辅料智能分析系统（科迈恩（北京）科技有限公司，软件PS80库中结合脂肪酸的组分仅为聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯类）；Agilent MassHunter PCDL Manager PS80相关扩展数据库（安捷伦公司提供，该扩展数据库中结合脂肪酸的组分包含了聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯类、聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯类、聚氧乙烯山梨醇酐棕榈酸酯类和聚氧乙烯山梨醇酐硬脂酸酯类组分）。

2 方法与结果

2.1 实验条件

参照文献以及ExcipientProfiler 药用辅料智能分析系统的SOP拟定了以下实验条件［10］。

2.1.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC Protein BEH C4柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸水（含5 μmol 乙酸钠）为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱：0 ~ 15 min，10% ~ 100% B；15 ~ 18 min，100% B；流速为0.4 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

2.1.2 质谱条件 Dual AJS ESI 离子源，正离子检测模式；干燥气流速：8 L/min；干燥气温度：250 ℃；雾化气压力：35 psi（1 psi= 6.895 kPa）；鞘气流速：11 L/min；鞘气温度：350 ℃；毛细管电压：4 000 V；喷嘴电压：500 V；扫描模式：Auto MS/MS；扫描范围：m/z100 ~ 3 000；Fragmentor：160 V；CE电压：80 eV（双电荷）、120 eV（单电荷）；动态排除，排除持续0.5 min。

2.2 样品制备

精密吸取样品10 μL，置于10 mL 玻璃离心管中，加入10%乙腈5 mL 溶解，涡旋1 min 混匀，用0.22 μm微孔过滤器过滤，取滤液进行分析。

2.3 ExcipientProfiler软件解析的结果

根据ExcipientProfiler 软件中的SOP 设置参数：以［PSM（n= 20）+ Na］+理论m/z1 331.827 3为校准参数，该成分保留时间允许的最小偏差≤1 min，最大偏差≤2 min；质谱分析中单电荷m/z偏差±0.005%，双电荷m/z偏差±0.005%。然后将适当格式的质谱数据导入，即可找到PS80 质谱图中加合Na+的不同组分峰及其相关信息：各组分的分布图（图2）、每一组分中含有不同聚合度化合物的数量（表1）和各组分的聚合度信息。

2.3.1 各组分的分布 以样品A1、A3、B1、C2 为例，PS80 中PEG、PS、PI 这3 类组分的保留时间为2.50~4.50 min，PSM、PIM、PM 这3 类组分主要的保留时间为8.50~10.00 min，PSD、PID、PD这3类组分的保留时间则分布在11.75 ~ 13.50 min 内，而PSTri 组分的保留时间为13.50 ~ 15.50 min，详见图2。比较发现PS80 中不同类组分保留时间的不同，与组分的亲水性和油酸基团数有关，这与文献所述相符［10］。

2.3.2 各组分的数量 比较样品中各个组分不同聚合度化合物的数量发现，每批样品中PSM、PIM、PM 这3 类组分的组分个数均为最多，且这3 类组分的组分数在注射级样品中占总个数约为70%，普通级样品中占总个数55% ~ 60%，即结合了一油酸酯的组分的组分数较多。从PS80的结构来看，这是因为已经结合了1分子油酸的聚氧乙烯侧链具有一定的空间位阻；同时由于结合一油酸酯的组分表面活性较强，争夺电荷的能力强，质谱响应高能被检出，所以结合二油酸酯和三油酸酯的组分组分数较低。但是注射级样品（A1、A2）较普通级样品组分总个数少，具体数据见表1，这可能与其生产工艺相关。

Figure 2 Total ion chromatogram of A1 (I-1), A3 (II-1), B1 (III-1) and C2 (IV-1); and component distribution map of A1 obtained by the Excipient‑Profiler software(I-2),A3(II-2),B1(III-2)and C2(IV-2)

2.3.3 各组分的聚合度 通过ExcipientProfiler软件对质谱结果的解析也能得到PS80样品各组分侧链中PEG 的聚合度n（n=x+y+z+w）。经过统计，10 批样品中PEG 组分的聚合度n可能在13 ~34 间，PS 组分n= 9 ~ 39，PI 组分n= 19 ~ 41，PSM组分n= 1 ~ 60，PIM 组分n= 1 ~ 60，PM 组分n=1~60，PSD 组分n=4~25，PID 组分n=3~59，PD组分n=4~60，PSTri组分n=10~49。由此可见，PS80 的单一组分中有不同聚合度的化合物，且各组分间的聚合度也不相同，因此对10 批样品中各组分的聚合度进行整理归纳，聚合度以中位数表示，详见表2。表中数据显示，注射级PS80 的PSD组分聚合度较普通级PS80 小，猜测可能是在生产注射级时对其酯化过程进行了控制，基于此能与普通级样品进行区分。

2.4 扩展数据库解析的结果

本研究所用为安捷伦提供的PS80扩展数据库（Agilent database），该扩展数据库的构建原理与ExcipientProfiler 软件中PS80 库相同，均是依据文献中PS80各组分聚合度与保留时间之间存在的关系来建立数学模型［10］。在此基础上，将质谱得到的结果与数据库中理论值进行匹配，并根据匹配得到结果进行筛选，以此来确定样品中含有的组分。与ExcipientProfiler 软件中PS80 库不同的是，扩展数据库中结合脂肪酸的组分不仅含有聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯类组分，还包括聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯类、聚氧乙烯山梨醇酐棕榈酸酯类和聚氧乙烯山梨醇酐硬脂酸酯类组分，且数据库能够将加合了Na+或的组分峰识别到。

Table 1 Polysorbate 80 component count of different grades from different enterprises obtained by the ExcipientProfiler software*

Table 2 Information of degree of polymerization of polysorbate 80 component obtained by the ExcipientProfiler software*

因此利用数据库对PS80 组分进一步分析发现，这10 批样品中不单单含有聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯类组分，还含有聚氧乙烯山梨醇酐其他脂肪酸酯类组分。注射级样品中含有结合了硬脂酸的PSM 组分（PSM-stearate）、结合了棕榈酸的PIM和PM 组分（PIM-palmitate、PM-palmitate）以及结合了月桂酸的PSTri 组分（PSTri-laurate）。除了上述组分，普通级样品中还包含了结合月桂酸和硬脂酸的PIM 组分（PIM-laurate、PIM-stearate）与PM 组分（PM-laurate、PM-stearate），结合月桂酸和棕榈酸的PSD 组分（PSD-laurate、PSD-palmitate），以及结合棕榈酸的PID组分（PID-palmitate）。说明油酸原料中不仅含有油酸，还有其他脂肪酸的存在，因此在PS80中具有一定量的其他脂肪酸酯类组分。此外，注射级样品的其他脂肪酸酯类组分数较普通级样品少（见表3），这与注射级样品所用的原料油酸纯度较高这一事实相符，且能佐证ExcipientPro‑filer软件中组分数比较结果。

3 讨 论

3.1 质谱参数的优化

ExcipientProfiler 软件中SOP 的质谱参数是依据Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 来设定的，而本研究采用的是Agilent 6546 Q-TOF，两者仪器硬件具有差异，故需要优化参数。通过改变干燥气流速、干燥气温度、鞘气流速、鞘气温度、雾化气压力以及碎裂电压的参数，来提高其离子响应。此外，由于本系统中［M+NH4］+响应较高，故加入适量乙酸钠增加了［M+Na］+的响应，以此来使ExcipientProfiler软件解析更加准确。

Table 3 Component count of polysorbate 80 combined with other fatty acids obtained by the Agilent database

3.2 组分数结果分析

采用SPSS 26.0 版软件，对ExcipientProfiler 软件解析的结果进行聚类分析，以表1中各组分的组分数为变量，采用组间联接，以平方欧式距离作为样品的测度，用系统聚类分析法对10 批样品进行分析，以此来对ExcipientProfiler 软件分析结果进行评价。结果发现，选用的10 批样品可聚为2 类，其中样品A1、A2 聚为一类，A3~A5、B1~B3、C1~C2 聚为一类，因此，从组分数的角度来看，Excipi‑entProfiler软件可对注射级与普通级样品进行区分（如图3-A所示）。

由于ExcipientProfiler 软件的PS80 库中仅包含聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯类组分，没有收录聚氧乙烯山梨醇酐其他脂肪酸酯类组分，此外，现行版ExcipientProfiler软件仅能识别到加合了Na+的组分峰，有误判漏判的风险出现，基于此，又采用安捷伦公司的扩展数据库对质谱数据进一步分析，并对分析结果聚类，结果见图3-B。当距离刻度为25时，发现扩展数据库的聚类结果与ExcipientProfiler软件的分析结果一致，均为两类；但当距离刻度为5时，扩展数据结果可以聚为3类，其中，B1~B3聚为一类，A3、A4、C1、C2 聚为一类，A5 单独为一类；当距离刻度逐渐变小，A3、A4 和C1、C2 能够被聚为两类，可见，扩展数据库的组分数结果对不同厂家有更好的区分度。

Figure 3 Dendrogram of cluster analysis of results from different methods

3.3 聚氧乙烯山梨醇酐四油酸酯的确证

由于ExcipientProfiler 软件和扩展数据库中均未收录PSTetra 组分的相关信息，故不能确定PS80中是否含有四酯结构，因此，本研究在此基础上对得到的质谱图进一步分析，以A1 样品为例，其PSTetra 组 分 在14.83 ~ 15.28 min 洗 脱 出 峰，其EIC图见图4。

将油酸相对分子质量以282.255 6 计，PEG 单体相对分子质量以44.026 2计，一失水山梨醇相对分子质量以164.068 5 计，H2O 的相对分子质量以18.010 6 计，的质量数以18.034 4 计，可推断出A1 样品中含有结合了四分子油酸的聚合度为n= 16 ~ 32 的PSTetra 组分，详见图4-A，其中响应最高的离子m/z2 208.662 2 是PSTetra-oleate（n=22）加合1个NH4+所形成的（理论m/z2 207.660 3）。图4-B 显示的是PSTetra-oleate 组分双电荷离子的质谱图，以m/z1 157.374 4的离子为例，为PSTetraoleate（n=24）加合2 个NH4+所形成的（理论m/z1 156.873 3）。由于H 同位素的存在，单电荷离子理论值和实际值相差约1，双电荷离子相差约0.5。

Figure 4 EIC mass spectrum of PSTetra component peak of A1 sample

4 结 论

本研究采用ExcipientProfiler 软件及PS80相关扩展数据库对收集到的10 批不同厂家PS80 进行组分分析，并对组分数结果采用系统聚类分析，证明ExcipientProfiler 软件能够快速便捷地分析PS80组分，具有能用来区分不同级别样品的优势。

但后续通过扩展数据库查找和质谱解析发现，PS80 中还存在四酯组分和其他脂肪酸酯类组分，而ExcipientProfiler 软件中缺少这些信息，故需要在扩展数据库的辅助下对PS80组分来进一步分析。因此，ExcipientProfiler 软件后续需要经过进一步的实验验证来完善其包含的信息库，以便能更准确地应用于PS80的组分分析。