睡菜提取物对牛蛙心肌、腓肠肌和十二指肠平滑肌影响的比较

谢婷婷，徐可，苏文霞，贺文静，沙爱龙

(1.重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 万州 404120；2.重庆三峡学院教师教育学院，重庆 万州 404120)

睡菜(MenyanthestrifoliateL.)为龙胆科(Gentianaceae)睡菜属(Menyanthes)的多年生草本，别名“绰菜、瞑菜”。主要分布在我国东北、云南、贵州等地，常生长于沼泽及浅水地区。《本草纲目》曰：“甘微苦，寒，无毒。治心膈邪热，不得眠”[1]。研究表明，睡菜化学成分丰富，主要含有黄酮类、甾醇类、萜类(三萜类、环烯醚萜类等)、挥发油类以及其他化合物，故具有养心安神、健脾消食、清热利尿等功效[2]。在古代民间部分地区已有将睡菜用作安神类药物食用的例子，此外，还有人将其用作啤酒的苦味剂。研究其食药用作用及机制，有望对其食药用价值的开发提供新思路。陈静文等研究发现睡菜中的环烯醚萜苷类化合物对于α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，使其对糖尿病药物开发具有指导意义[3-5]。睡菜提取物不同极性部位的比较研究表明，睡菜乙酸乙酯部位和正丁醇部位对小鼠的镇静催眠作用最为显著[6]。此外，睡菜还具有一定的抗炎作用，有助于缓解胃炎患者的症状[7-8]。在已有的研究中，尚未见睡菜提取物对心脏、骨骼肌和肠平滑肌的影响探究。心肌、骨骼肌和肠平滑肌在细胞结构、收缩性、兴奋性、传导性等生理特性和收缩机制方面均不尽相同，因此当睡菜提取物作用于心肌、骨骼肌和肠平滑肌时，对三者生理特性影响程度和变化很可能不同。本研究选用不同浓度睡菜提取物对牛蛙离体心脏、在体腓肠肌及十二指肠平滑肌标本进行常规药理实验，初步探讨睡菜提取物对心肌、腓肠肌和十二指肠平滑肌的影响及作用机制，以期进一步为睡菜的药用价值提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

牛蛙32只(购于重庆市万州区五桥永辉超市)，雌雄各半，体质量约200～260 g。

1.2 药品与仪器

睡菜于2020年8月采集于湖北省神农架大九湖，经本课题组鉴定为龙胆科睡菜属植物睡菜(MenyanthestrifoliateL.)的全草。任氏液(6.5 g NaCl、0.14 g KCl、0.12 g CaCl2、0.2 g NaHCO3、0.01 g NaH2PO4、2 g葡萄糖、1000 mL蒸馏水，混匀)。电子天平(上海津平科学仪器有限公司)，BL-420F生物信号采集处理系统、肌张力换能器、HW-400SE恒温平滑肌槽、斯氏蛙心插管、蛙心夹和引导电极，均为成都泰盟软件有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 睡菜提取物的制备 取干燥睡菜全草2 g，剪碎后置于烧杯中，加入100 mL蒸馏水，煮沸后过滤，洗涤滤渣，合并滤液以蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，得20 mg/mL高浓度睡菜提取物。后稀释2次，各稀释1倍，得10 mg/mL中浓度和5 mg/mL低浓度的睡菜提取物。

1.3.2 睡菜提取物对心脏的影响 采用斯氏蛙心插管法对牛蛙心脏进行离体[9]，用任氏液进行换洗并保持套管内含任氏液高度在1.5 cm左右，随后用蛙心夹夹取少许蛙心尖，蛙心夹再通过细线连接张力换能器，换能器连接BL-420生物信号采集处理系统后开始实验。待蛙心收缩稳定后记录曲线，以此作为对照组，然后分别滴加不同浓度的睡菜提取物溶液，记录加药后的收缩曲线，待心脏收缩稳定后用任氏液快速换洗2～3次。分析各浓度组加样前后心脏的收缩幅度和心率的变化。此后分别用CaCl2(2%)、NaCl(5%)和KCl(1%)溶液对离体心脏进行诱导试验，待其作用至曲线稳定时加入高浓度的睡菜提取物，观察并记录其对离体蛙心收缩频率和收缩幅度的影响。

1.3.3 睡菜提取物对腓肠肌的影响 将牛蛙进行双毁髓，参照文献方法制备牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌标本[10]，分离出在体腓肠肌并滴加任氏液浸润标本，于跟腱处连接张力换能器，启动生物信号采集处理系统，设置刺激参数，采用单刺激，刺激强度从0.1 V开始，每次递增0.1 V，记录肌肉出现收缩的最小电压强度(阈刺激强度)和肌肉出现最大收缩的最小电压强度(饱和刺激强度)。随后将标本取下，浸泡在盛有高浓度睡菜提取物的培养皿中10 min，再次连接张力换能器，记录阈刺激强度和最大刺激强度。

1.3.4 睡菜提取物对十二指肠平滑肌的影响 牛蛙双毁髓处死后，迅速剖开腹部，将十二指肠中残留内容物撵至空肠，去除肠系膜后剪取2 cm长的肠段，用浸润过任氏液的细棉线在肠段两端结扎，一端固定在恒温平滑肌槽试管底端的“L”型弯钩上(肠段应全浸在任氏液中)，另一端连接张力换能器，注意调整肠段与张力换能器之间连线的力度，使其能够顺利进行收缩。在记录离体肠正常收缩5 min后，采用低、中、高浓度的睡菜提取物对离体十二指肠的收缩幅度及频率进行测试，每次加药后应待肠段达到稳定状态后记录收缩曲线。此后分别用CaCl2(2%)、NaCl(5%)和KCl(1%)溶液对牛蛙离体肠平滑肌标本进行诱导试验，待其作用至曲线稳定时加入高浓度的睡菜提取物，观察并记录其对十二指肠平滑肌标本收缩频率和收缩幅度的影响。

1.3.5 数据记录 牛蛙坐骨神经-腓肠肌标本加样前后的阈刺激强度和饱和刺激强度，以及肌肉收缩的潜伏期(ms)，收缩幅度(g)，收缩时间(ms)，舒张幅度(g)，舒张时间(ms)，并计算：收缩速率=收缩幅度/收缩时间(g/ms)，舒张速率=舒张幅度/舒张时间(g/ms)。

牛蛙离体心脏加药前后的收缩幅度(g)、心率(次/min)。

牛蛙离体十二指肠平滑肌标本加药前后的收缩幅度(g)与频率(次/min)。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 睡菜提取物对心脏的影响

2.1.1 睡菜提取物对牛蛙离体心脏心率的影响 由表1和图1可知，3种浓度的睡菜提取物均可抑制离体蛙心的心率，虽与给药前相比无显著差异(P>0.05)，但从抑制率来看，抑制程度随浓度升高而增强，表现出一定的剂量依赖关系。高浓度睡菜提取物灌流后期，部分离体心脏停止跳动。表明睡菜提取物可降低牛蛙心率，影响其自律性。

2.1.2 睡菜提取物对牛蛙离体心脏收缩力的影响 由表2和图1可知，3种浓度的睡菜提取物对牛蛙离体心脏收缩力均具有抑制作用。其中低、中浓度组差异均显著(P<0.05)，高质量浓度组抑制极显著(P<0.01)，且抑制程度随浓度升高而增强，表现出一定的剂量依赖关系。这表明睡菜提取物可通过降低离体心脏标本的收缩幅度而抑制其收缩现象。

表1 睡菜提取物对离体蛙心心率的影响

表2 睡菜提取物对牛蛙离体心脏心肌收缩力的影响

图1 睡菜提取物对牛蛙心脏收缩的影响Figure 1 Effects of Menyanthes trifoliate extract on the heart contraction of bullfrog

2.1.3 睡菜提取物对CaCl2、NaCl和KCl分别诱导的牛蛙离体心脏收缩幅度和心率的影响 由表3和图2可知，与给药前相比，CaCl2可增加离体心脏标本的心率(P>0.05)和收缩幅度(P<0.01)。加入高浓度睡菜提取物后，心率虽有降低但不显著，收缩幅度降低现象显著(P<0.05)。NaCl可降低离体心脏标本的心率和收缩幅度(P>0.05)。加入高浓度睡菜提取物后，心率和收缩幅度虽有上升趋势但作用不显著(P<0.05)。KCl可显著降低离体心脏标本的心率(P<0.05)，收缩幅度有所下降但作用不显著。加入高浓度睡菜提取物后，心率和收缩幅度的抑制作用均较为显著(P<0.05)。

图2 睡菜提取物对CaCl2、KCl和NaCl分别诱导的牛蛙离体心脏收缩的影响Figure 2 Effects of Menyanthes trifoliate extract on the heart contraction induced by CaCl2、NaCl and KCl in vitro of bullfrog

2.2 睡菜提取物对腓肠肌的影响

2.2.1 睡菜提取物对牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌阈刺激与最大刺激的影响 从表4可知，浸润高浓度睡菜提取物后，牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌的阈刺激强度和最大刺激强度均显著升高，浸润前后的差异均具有统计学意义(P<0.05)。这表明高浓度的睡菜提取物可通过升高该标本的电刺激强度，从而降低对外界电刺激的敏感性。

表3 睡菜水提物对CaCl2、KCl和NaCl分别诱导的牛蛙离体心脏收缩幅度和心率的影响

表4 睡菜提取物对牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌阈刺激和最大刺激的影响

2.2.2 睡菜提取物对牛蛙在体腓肠肌收缩潜伏期、收缩幅度、收缩速率和舒张速率的影响 由表5和图3可知，在体坐骨神经-腓肠肌浸润高浓度睡菜提取物后，标本的收缩潜伏期和收缩速率均呈现明显降低趋势，且与浸润前相比具有极显著差异(P<0.01)；收缩幅度也明显降低，浸润前后差异具有统计学意义(P<0.05)；舒张速率虽有所降低但差异不显著(P>0.05)。

表5 睡菜提取物对牛蛙在体腓肠肌收缩潜伏期、收缩幅度、收缩速率和舒张速率的影响

A：浸润前；B：浸润睡菜提取物后。A.Before the invasion；B.After infiltration of Menyanthes trifoliate extract.图3 睡菜提取物对牛蛙在体腓肠肌单收缩的影响Figure 3 Effects of Menyanthes trifoliate extract on the single twitch of the gastrocnemius muscle in vivo of bullfrog

2.3 睡菜提取物对十二指肠平滑肌的影响

2.3.1 睡菜提取物对牛蛙离体十二指肠平滑肌收缩性的影响 由表6可知，3个浓度组的睡菜提取物对离体肠平滑肌标本的收缩幅度均有极显著的抑制作用(P<0.01)，且从抑制率上看，随着浓度的增加，抑制程度越显著，呈现一定的量效关系。

2.3.2 睡菜提取物对牛蛙离体十二指肠平滑肌收缩频率的影响 由表7可知，3个浓度组的睡菜提取物都可使十二指肠的收缩频率降低，其中低浓度组给药前后无显著差异(P>0.05)，中浓度组抑制作用显著(P<0.05)，高浓度组表现为极显著差异(P<0.01)。从抑制率上看，抑制作用随着浓度的升高而增强，呈现一定的量效关系。

表6 睡菜提取物对牛蛙离体十二指肠收缩幅度的影响

表7 睡菜提取物对牛蛙离体十二指肠收缩频率的影响

2.3.3 睡菜提取物对CaCl2、KCl和NaCl分别诱导的离体小鼠十二指肠收缩幅度和收缩频率的影响 由图4可知，与给药前相比，CaCl2可显著促进牛蛙离体肠平滑肌的收缩频率(P<0.05)和收缩幅度(P<0.01)；加入高浓度睡菜提取物后，该标本的收缩频率有所下降(P>0.05)，收缩幅度受到显著抑制(P<0.05)。NaCl可显著抑制牛蛙离体肠平滑肌的收缩频率，收缩幅度有所下降但无显著差异；加入高浓度睡菜提取物后，收缩频率显著上升(P<0.05)，收缩幅度呈现上升趋势但无显著差异。KCl对该标本的收缩频率和收缩幅度均有促进作用，其中收缩幅度的促进作用较为显著(P<0.05)；加入高浓度睡菜提取物后，收缩频率和收缩幅度均受到抑制(P>0.05)。

*和** 表示给药前后相比较，*P<0.05，** P<0.01；#表示与CaCl2、NaCl和KCl干预后相比较，#P<0.05。*和** indicates comparison before and after administration,*P<0.05，** P<0.01；# indicate comparison with after the CaCl2、NaCl and KCl intervention,#P<0.05.图4 睡菜提取物对CaCl2、KCl、NaCl分别诱导的牛蛙离体十二指肠收缩幅度和频率的影响Figure 4 Effects of Menyanthes trifoliate extract on the contractile amplitude and rate of duodenum induced by CaCl2、NaCl and KCl in vitro of

3 讨论

现代药物分析和药理学研究表明，睡菜之所以具有养心安神、健脾消食等功效与其含有黄酮类、甾醇类、萜类(三萜类、环烯醚萜类等)、挥发油类等化学成分有关[2]。也有研究表明，植物黄酮类化合物能影响心肌、肠平滑肌，如黄芪总黄酮可以抑制病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞钙电流，且通过干扰细胞外Ca2+的内流影响内质网中Ca2+的释放，松弛心肌[11]；唐春萍等[12]发现高良姜总黄酮能显著抑制家兔体外回肠收缩，该效应可能与通过胆碱能受体、H受体介导、Ca2+通道或对回肠平滑肌直接起作用有关。已有研究报道，环烯醚萜类化合物作为众多植物药物的有效成分之一，对心肌、肠平滑肌都表现出一定的生物活性[13]，如龙胆科獐牙菜属植物中的环烯醚萜类化合物獐牙菜苦苷对解除肠平滑肌痉挛性疼痛有良好效果，且较阿托品类药物的副作用小[14]。本研究结果表明，睡菜提取物能明显抑制牛蛙离体十二指肠平滑肌的收缩，或是与已有研究报道的睡菜全草中环烯醚萜类化合物含量也较为丰富[2]相关，本研究结果与唐春萍等[12]研究结果一致。

肌肉收缩主要与Ca2+浓度有关，心肌细胞与骨骼肌细胞不同，其肌质网不如骨骼肌发达，贮存的Ca2+量较少，其兴奋-收缩耦联过程高度依赖于胞外Ca2+的内流。研究结果显示，三种浓度的睡菜提取物均可显著抑制离体蛙心的收缩幅度，降低心率，且表现为一定的量效关系。已有研究发现睡菜中所含环烯醚萜类化合物成分京尼平苷酸对大鼠心脏有显著负性肌力作用、负性变时作用以及负性冠状动脉灌注率作用[15]。黄酮类化合物可通过干扰心肌细胞胞外Ca2+内流，降低胞内Ca2+浓度促使心肌主动松弛实现对心血管系统的保护作用[11]。推测睡菜提取物中所含环烯醚萜类化合物及黄酮类化合物可能是引起离体蛙心收缩抑制的主要活性成分。为探究睡菜提取物抑制心脏的机制，本研究进一步观察了Ca2+、Na+和K+孵育状态下加入高浓度睡菜提取物后心肌的收缩变化，结果显示：Ca2+孵育状态下离体蛙心的收缩幅度和频率均有增强，但加入高浓度睡菜提取物后，收缩幅度显著降低，心率减缓。可见高浓度睡菜提取物能抑制CaCl2对牛蛙离体心肌的收缩作用，很可能是通过抑制牛蛙离体心脏细胞外Ca2+内流，降低胞内Ca2+浓度从而影响心肌细胞收缩，此与齐梁煜[16]等研究结果相似。另一结果表明：Na+可抑制离体蛙心的收缩幅度和频率，加入高浓度睡菜提取物后，可减缓收缩幅度与心率的抑制情况。说明高浓度睡菜提取物可在一定程度上抵消Na+引起的牛蛙离体心脏心肌收缩力降低、心率减缓现象。同时发现：睡菜提取物可加强K+孵育状态下离体蛙心的收缩抑制作用，进一步抑制其收缩。当细胞外液K+浓度增大时，静息电位绝对值会因为膜内外K+浓度差减小从而降低，此时所产生的动作电位幅度也相对减小；当动作电位传导至二联体结构时，因钙库中释放的Ca2+量减小或Ca2+内流受到抑制，导致心肌收缩力减弱。与此同时，由于静息电位绝对值过低，Na+通道无法激活，无动作电位产生，心肌自然无法收缩。

骨骼肌的收缩能力受肌膜内外离子运动的影响，当主要离子Na+、K+浓度发生变化时，可影响膜电位的形成，进而影响肌肉的收缩[17]。阈电位水平主要与电压门控钠通道的功能状态有关，当细胞外Ca2+水平较高时，会使得膜对Na+的通透性减小，抬高阈电位，兴奋性降低；反之则会使细胞的兴奋性升高[18]。本研究结果表明，高浓度睡菜提取物可显著增强牛蛙在体坐骨神经-腓肠肌标本的阈刺激和最大刺激强度，由此推测睡菜提取物通过作用于电压门控钠通道，抑制Na+的内流，从而使得阈电位升高，降低标本的兴奋性。在骨骼肌神经-肌接头的兴奋传递过程中，冯德培提出Ach的释放具有Ca2+依赖性，接头前膜产生的动作电位可激活前膜的电压门控钙离子通道，促进Ca2+内流而触发囊泡的出胞，因此Ca2+浓度可影响兴奋的传递[18]。本研究中，睡菜提取物可减少在体腓肠肌标本的收缩潜伏期，降低其收缩幅度、速率和舒张速率，这可能与前膜Ach的释放受到抑制以及后膜N2型Ach受体阳离子通道受阻有关。睡菜提取物可能通过降低前膜胞外Ca2+浓度来影响其内流，抑制Ach的释放；或者特异性阻断后膜N2型Ach受体阳离子通道从而降低腓肠肌标本的收缩幅度和速率，具体机制仍需做进一步验证。

牛蛙离体肠段虽然失去外来神经的支配，但是壁内神经丛仍存在，在适宜条件下仍能保持平滑肌的收缩特性及肠壁神经丛的作用[19]。研究表明，十二指肠的活动受到神经和体液因素调节，同时也受到中药中某些化学成分的影响[20]。Ca2+是引起平滑肌收缩运动的关键离子，小肠平滑肌的收缩主要取决于胞内钙离子的浓度，而这又依靠细胞外钙离子内流以及胞内钙离子的释放[21]。本研究表明低、中、高浓度组睡菜提取物均能显著抑制十二指肠平滑肌标本的收缩幅度，降低收缩频率，且呈量效关系。为探究睡菜提取物对十二指肠的影响，本研究进一步观察了Ca2+、Na+和K+孵育状态下加入高浓度睡菜提取物后离体肠标本收缩特性的变化。结果表明：Ca2+孵育状态下十二指肠的收缩幅度和频率均有增强，但加入高浓度睡菜提取物后，CaCl2引起的离体平滑肌收缩活动几乎完全被抑制。这可说明睡菜提取物可在一定程度上减少胞外Ca2+内流从而对离体肠段的收缩进行抑制。另一结果表明：Na+可抑制离体肠的收缩幅度和频率，但加入高浓度睡菜提取物后，可抵消Na+引起的收缩幅度减小、频率减缓。而K+可促进十二指肠的收缩作用，高浓度睡菜提取物则会抑制其收缩，这可能与睡菜中的化学成分有关。有研究表明，植物黄酮类化合物可能通过胆碱能受体、H受体介导、Ca2+通道或对平滑肌直接起作用抑制家兔离体回肠的收缩。环烯醚萜类化合物对消化系统也具有一定的生物活性。如马养民和汪洋[22]、张慧娟等[14]和马丽娜等[23]发现獐牙菜苦苷可抑制大鼠和兔离体十二指肠及子宫平滑肌的收缩，临床也初步证实其具有较好的解痉止痛及改善睡眠的作用；缬草环烯醚萜酯具有解除平滑肌痉挛、镇静等作用[24]。由此推测睡菜提取物抑制十二指肠平滑肌的收缩可能与其所含的黄酮类化合物和环烯醚萜类化合物有关，具体是哪种成分起到关键作用有待于进一步研究证实。

4 结论

综上所述，睡菜提取物对心肌、骨骼肌及十二指肠平滑肌的收缩均具有抑制作用。且睡菜提取物可抑制CaCl2对牛蛙离体心脏和十二指肠平滑肌的收缩，减缓NaCl对心肌及肠平滑肌的收缩抑制，加强KCl对心肌的收缩抑制，抑制KCl对肠平滑肌的收缩。总之，睡菜提取物对三种肌肉收缩的抑制作用与其所含成分对离子通透性的影响有关，具体对Ca2+、Na+、K+和Cl-通透性影响的具体机制还需进一步研究。