LncRNA和PD-L1表达与卵巢癌患者化疗耐药性的关系分析

王宜峰　朱新海　李翠

【摘要】 目的：分析长链非编码RNA（LncRNA）和程序性死亡配体1（PD-L1）表达与卵巢癌患者化疗耐药性的关系。方法：收集2019年1月-2020年12月于暨南大学附属第一医院就诊的128例卵巢癌患者临床资料进行回顾性分析，其中铂类药物耐药患者69例设为耐药组，铂类药物敏感患者59例设为敏感组，比较两组的卵巢癌组织中LncRNA与PD-L1的表达情况，分析患者LncRNA和PD-L1的表达与卵巢癌患者化疗耐药性的关系。结果：对LncRNA的两个分子[生长阻滞特异性转录因子5（GAS5）、HOXC基因座转录因子（HOTAIR）]进行分析，耐药组以上两个LncRNA分子的表达水平均明显高于敏感组（P<0.05），耐药组PD-L1表达水平明显高于敏感组（P<0.05）;多因素logistic回归分析显示，GAS5、HOTAIR与PD-L1均为卵巢癌患者化疗耐药的独立危险因素（P<0.05）;PD-L1表达水平和GAS5、HOTAIR表達水平均呈显著正相关（P<0.05）;肿瘤细胞平均抑制率为（36.63±6.53）%，与PD-L1、GAS5、HOTAIR表达水平均呈负相关（P<0.05）。结论：卵巢癌组织中LncRNA的GAS5、HOTAIR分子与PD-L1的高表达与卵巢癌患者化疗耐药性密切相关，LncRNA与PD-L1相互协同，促进肿瘤细胞耐药。

【关键词】 LncRNA PD-L1 化疗耐药性 卵巢癌

Analysis of the Relationship between the Expression of LncRNA and PD-L1 and Chemoresistance in Patients with Ovarian Cancer/WANG Yifeng， ZHU Xinhai， LI Cui. //Medical Innovation of China， 2022， 19（11）： -173

[Abstract] Objective： To analyze the relationship between the expression of long non-coding RNA （LncRNA） and programmed death ligand 1 （PD-L1） and chemoresistance in patients with ovarian cancer. Method： The clinical data of 128 patients with ovarian cancer treated in the First Affiliated Hospital of Ji’nan University from January 2019 to December 2020 were collected and analyzed retrospectively， among them， 69 patients with platinum drug resistance were set as the drug-resistance group and 59 patients with platinum drug sensitivity were set as the sensitive group. The expression of LncRNA and PD-L1 in ovarian cancer tissues of the two groups were compared， the association between LncRNA and PD-L1 expression and chemoresistance in patients with ovarian cancer was analyzed. Result： Two molecules of LncRNA [growth arrest specific transcription factor 5 （GAS5） and HoxC locus transcription factor （HOTAIR）] were analyzed， the expression levels of these two LncRNA molecules in drug-resistant group were significantly higher than those in sensitive group （P<0.05）， and the expression level of PD-L1 in drug-resistant group was significantly higher than that in sensitive group （P<0.05）; multivariate logistic regression analysis showed that GAS5， HOTAIR and PD-L1 were independent risk factors of chemotherapy resistance in ovarian cancer patients （P<0.05）. The expression level of PD-L1 was significantly positively correlated with the expression levels of GAS5 and HOTAIR （P<0.05）; the average inhibition rate of tumor cells was （36.63±6.53）%， which was negatively correlated with the expression levels of PD-L1， GAS5 and HOTAIR （P<0.05）. Conclusion： The high expression of GAS5， HOTAIR in LncRNA and PD-L1 of ovarian cancer is closely related to chemotherapy resistance of ovarian cancer patients， LncRNA and PD-L1 cooperate with each other to promote drug resistance of tumor cells.

[Key words] LncRNA PD-L1 Chemoresistance Ovarian cancer

First-author’s address： Guangzhou Ping’an Hao Medical Laboratory Co.，Ltd.， Guangzhou 510670， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.11.042

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤中常见的一种恶行肿瘤，其死亡率长期位居各种妇科肿瘤中的首位，其中导致其高死亡率的两大原因为早期诊断困难和患者的耐药性，同时治疗失败的原因亦多为耐药性，卵巢癌患者出现多药耐药通常由肿瘤组织中异质细胞群中的耐药细胞引起[1-2]。目前，已有研究表明长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）与程序性死亡配体-1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）对卵巢癌的进展起到促进作用，且两者具有协同作用[3-5]。因此本研究对128例患者卵巢癌组织细胞LncRNA与PD-L1表达水平进行分析，探讨两项指标与卵巢癌患者化疗耐药性的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 组织标本来源 收集2019年1月-2020年12月于暨南大学附属第一医院就诊的128例确诊为卵巢癌患者的临床资料进行回顾性分析。128例卵巢癌患者中，铂类药物耐药患者69例设为耐药组，铂类药物敏感患者59例设为敏感组。纳入标准：根据《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2019年版）》诊断标准确诊为卵巢癌患者[6];均行肿瘤细胞减灭术或根治术后接受以铂类为基础的化疗辅助治疗。患者顺铂耐药性判定标准：根据疗效情况评价，残留病灶消失并持续1年以上为完全缓解;残留病灶缩小30%并维持1个月以上为部分缓解;残留病灶缩小<30%为稳定;残留病灶体积增加>25%或者有新增则为进展[7]，完全缓解+部分缓解+稳定视为顺铂敏感，进展则视为顺铂耐药;资料完整者。排除标准：有既往恶性肿瘤史，术前行化疗辅助治疗。本研究已经医院伦理学委员会批准。

1.1.2 主要试剂 PCR试剂盒[Takara（宝）生物股份有限公司，批号AK8606]，LncRNA引物[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]，细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）（Abcam公司，批号BGPTQC71P66），免疫组织化学法检测试剂盒（上海羽朵生物科技有限公司，批号YDJ4123）。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR检测LncRNA的表达 根据文献检索结果，本研究主要针对两个LncRNA分子，即生长阻滞特异性转录因子5（GAS5）和HOXC基因座转录因子（HOTAIR）进行分析;GAS5基因引物序列，上游：CTTGCCTGGACCAGCTTAAT，下游：CAAGCCGACTCTCCATACCT;HOTAIR基因引物序列，上游：GGGGCTTCCTTGCTCTTCTTATC，下游：GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC。PCR在条件95 ℃ 15 s、51 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s扩增40循环。

1.2.2 采用免疫组化学法检测PD-L1表达水平 制作组织连续切片，切片厚度约为4 mm，石蜡包埋，0.1 mL柠檬酸盐121 ℃环境下冲洗10 min，3%過氧化氢孵育5 min，0.5%山羊血阻断60 min，在4 ℃环境下将切片与PD-L1孵育过夜，再用苏木素重复染色，免疫组化试剂盒检测。

1.2.3 体外药物敏感实验 采用噻唑蓝（MTT）比色法检测。将肿瘤组织研磨至分散，在无菌环境下，0.9%生理盐水漂洗2次，剪碎，加入0.25%胰蛋白消化酶。200目细胞筛制成单细胞混悬液，台盼蓝染色，加入顺铂（生产厂家：齐鲁制药有限公司，批准文号：国药准字H37021358，规格：10 mg）20 μg/mL，震荡摇匀，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养48 h。介入5 mg/mL的四甲基偶氮唑盐（MTT）20 μL/孔，继续培养3～24 h，显微镜下观察MTT被还原成蓝色结晶结束培养。细胞培养液1 000 r/min离心10 min，去上层清液，采用酶标仪测吸光度，并计算肿瘤细胞平均抑制率。

1.3 观察指标及评价标准 （1）采用2-ΔΔCt公式计算GAS5和HOTAIR基因的相对表达量，其中-ΔΔCt=ΔCt（标准基因）-ΔCt（目标基因），Ct为循环阈值。（2）PD-L1阳性染色强度评分：0分为无染色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕色;阳性率评分：在显微镜下随机选取10个视野，每个视野中100个细胞计数，1分为阳性率少于25%，2分为25%～50%，3分为>50%且≤75%，4分为>75%;染色强度评分与阳性率评分的乘积结果为PD-L1的表达强度评分。（3）采用Pearson相关性分析法分析PD-L1表达水平和GAS5、HOTAIR表达水平的相关性，PD-L1、GAS5、HOTAIR表达水平与肿瘤细胞平均抑制率相关性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对数据进行分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料用率（%）表示，组间比较采用字2检验，logistic回归分析，Pearson相关性分析法分析相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌化疗耐药性单因素分析 两组FIGO分期、残留病灶大小、淋巴结转移、GAS5、HOTAIR和PD-L1的表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05），且耐药组GAS5、HOTAIR和PD-L1的表达水平均高于敏感组（P<0.05）。见表1。

2.2 卵巢癌化疗耐药性危险因素logistic回归分析 FIGO分期、残留病灶大小、淋巴结转移和GAS5、HOTAIR及PD-L1表达水平纳入多因素logistic回归分析，结果显示：GAS5、HOTAIR及PD-L1表达水平均为卵巢癌患者化疗耐药性独立危险因素（P<0.05），见表2。

2.3 PD-L1表达水平和GAS5、HOTAIR表达水平的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，PD-L1表达水平和GAS5、HOTAIR表达水平均呈显著正相关关系（r=0.460、0.294，P=0.000、0.001）。

2.4 PD-L1、GAS5、HOTAIR表达水平与肿瘤细胞平均抑制率相关性分析 肿瘤细胞平均抑制率为（36.63±6.53）%，与PD-L1、GAS5、HOTAIR表达水平均呈负相关（r=-0.371、-0.412、-0.287，P=0.000、0.000、0.001）。

3 讨论

相关研究表明，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）包括miRNA、siRNA、piRNA和LncRNA，均可在卵巢癌细胞发生转移以及化疗耐药性发展中作为基因表达重要的调控因子，其起着重要的作用[8]。其中的LncRNA已被证实参与肿瘤细胞的增殖、凋亡与转移等多个过程，与卵巢癌的发展存在相当密切的关系[9-11]。LncRNA根据不同的作用机制分别参与卵巢癌组织细胞的敏感性以及耐藥性。目前已发现越来越多的与化疗耐药性相关的LncRNA分子，如LncRNA EBIC、lncRNA HOTAIR等[12]。本研究中根据文献[2]检索，选取两个LncRNA分子：GAS5和HOTAIR作为分析对象，对LncRNA与耐药性的关系进行分析。本研究结果显示，耐药性卵巢癌组织细胞GAS5和HOTAIR基因表达水平高于化疗敏感性卵巢癌组织细胞，logistic多因素回归分析结果显示，GAS5和HOTAIR基因均为卵巢癌细胞耐药性独立危险因素，且二者均对耐药性具有一定的诊断效能。GAS5定位于细胞质中，其在卵巢癌细胞耐药中发挥作用的机制可能为GAS5的高表达，通过对p53信号通路和MAPK信号通路的调节而调节卵巢癌耐药性。HOTAIR基因作为LncRNA的一员，长度为2 158 nt，在各种恶性肿瘤如卵巢癌、肝癌等均表达上调。研究表明，HOTAIR基因的表达与肿瘤细胞的转移、耐药以及复发具有相关性[13]。HOTAIR表达水平与p21mRNA表达呈负相关，而p21的功能丧失可介导耐药性，同时HOTAIR可通过调节p53信号通道来调节耐药性。

肿瘤免疫治疗中PD-1是一种免疫共抑制分子，主要在活化的CD8+T细胞、B细胞、CD4+细胞上[14]。PD-L1是PD-1的受体，有研究显示其在胃癌、肠癌、肝癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤组织细胞中均呈高表达[15]。有报道显示，PD-L1通过抑制CD8+T淋巴细胞参与肿瘤细胞的免疫逃逸机制，此可能与肿瘤细胞耐药性有关[15-17]。本研究结果显示，耐药性耐药性卵巢癌组织细胞PD-L1表达水平明显高于化疗敏感肿瘤细胞，logistic多因素回归分析结果显示PD-L1为卵巢癌细胞耐药性独立危险因素，且对耐药性具有一定的诊断效能;表明PD-L1参与卵巢癌细胞耐药性上调机制。

本研究中Pearson相关性分析结果显示，PD-L1表达水平和GAS5、HOTAIR表达水平均呈显著正相关关系，肿瘤细胞平均抑制率与PD-L1、GAS5、HOTAIR表达水平均呈负相关。有研究表明，LncRNA与PD-L1之间存在着非常紧密的关系[18]，如LncRNA HOTTIP和LncRNA EMX2OS等与PD-L1呈正相关，其可通过向上调节PD-L1的表达而抑制机体免疫答应，促进卵巢癌细胞的免疫逃逸。由此可见，LncRNA参与化疗耐药性相关基因与PD-L1有协调促进作用，相互协同促进肿瘤细胞的发展及耐药性的产生。

综上所述，卵巢癌组织中LncRNA中的GAS5、HOTAIR分子与PD-L1的高表达与卵巢癌患者化疗耐药性密切相关，均可作为卵巢癌化疗耐药性预测指标，联合检测具有一定的诊断效能。但是LncRNA种类繁多、功能复杂，各类LncRNA在肿瘤中的作用机制还需更多的实验研究以及临床试验验证探讨。

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（收稿日期：2021-07-27） （本文编辑：占汇娟）