生防菌HY-19的鉴定及其抑菌物质研究

路兆军 苗杰 刘瑞珍 马旭升 赵莹 王淑惠 李保进

摘要 [目的]明确HY-19的抑菌物质特性及其分类地位。[方法]以苹果褐斑病等为靶标采用平板对峙法分析其拮抗谱，对HY-19进行形态观察、生理生化测定和分子鉴定及其抑菌物质特性研究。[结果]菌株HY-19拮抗活性强且抑菌谱广，综合形态、生理生化及系统发育树分析，确定HY-19为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）。HY-19无菌滤液对病原指示菌有拮抗活性，且酸碱稳定性、蛋白酶、抗紫外辐射表现良好。HY-19含有丰原素等4种抑菌代谢产物合成基因，表明该菌株可能产生抗菌肽类物质，从而达到抑菌效果。[结论]该研究为苹果病原真菌的生防制剂开发与利用提供科学依据。

关键词 短短芽孢杆菌;生物防治;苹果病原真菌;抑菌物质

中图分类号 S 432.9  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）08-0090-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.024

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Identification of Biocontrol Strain HY-19 and Its Antibacterial Substances

LU Zhao-jun， MIAO Jie， LIU Rui-zhen et al

（Yantai Forest Resources Monitoring and Protection Service Center， Yantai， Shandong 264000）

Abstract [Objective]In order to confirm the taxonomic position of HY-19 and its antibacterial substance characteristics.[Method]The inhibitory spectrum of HY-19 targeting to apple pathogenic fungi such as Apple Marssonina Leaf Blotch was analyzed by flat-stand method， then the morphological observation， physiological and biochemical determination， molecular identification and antibacterial properties of HY-19 were studied. [Result]The results showed that HY-19 had strong antagonistic activity and broad spectrum of inhibition. HY-19 was identified as Bacillus brevis through morphological， physiological and biochemical and phylogenetic tree analysis. The fermentation filtrate of HY-19 had antagonistic activity against pathogen indicator which showed good acid-base stability， proteolysis-resistant and UV-resistant. HY-19 contains four kinds of antimicrobial metabolite genes such as fengycin which suggested that the strain may produce antimicrobial peptides to achieve antibacterial effect. [Conclusion]This study will lay a foundation for the development and utilization of biocontrol agents against apple pathogenic fungi.

Key words Bacillus brevis;Biocontrol;Apple pathogenic fungi;Antibacterial substances

芽孢桿菌因其分布广泛、对人畜和环境安全、抗逆性高、抑菌谱广、生产成本相对较低等优点被开发成为杀菌剂用于植物病害的生物防治 [1]。拮抗芽孢杆菌产生的抑菌物质能够有效抑制植物病原真菌或细菌的生长，从而达到防病和促生的效果 [2]。如Chandel等 [3]研究发现，该菌可防治由尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起的番茄枯萎病;Bapat等 [4]研究表明，该菌可产生孢外拮抗物质来抑制豌豆枯萎病原菌的孢子萌发、菌丝生长;杨廷雅等 [5]研究发现，菌株HAB-5产生的14.4 kDa肽对橡胶炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉枯萎病（Fusarium oxysporum f. sp.Cubense，FOC）、香蕉炭疽病（Colletotrichum musae）等多种病原菌均有拮抗活性;菌株MH1对棉花枯萎病（Rhizoctoniasolani Kuhn）有明显的拮抗作用 [6];菌株MHQl产生的抗菌物质正丁醇对杨桃炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香石竹疫霉（P hytophthora nicotianae）等多种植物病原真菌有拮抗作用 [7]。

苹果斑点落叶病、褐斑病等在我国山东、陕西等苹果主产区发生普遍且危害严重，是我国苹果生产上的主要病害 [8-9]。病情大流行时，果树叶片在8—9月即大量提前脱落，严重削弱树势，影响果树的正常生长发育及来年苹果的产量与质量 [10]。

HY-19为从苹果根际土壤中分离得到的1株细菌，对苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternata Kiessl）、苹果褐斑病菌（Marssonina coronaria Davis）、苹果轮斑病菌（Alternaria mali Roberts）等多种苹果重要病害具有明显的拮抗作用。笔者以苹果褐斑病菌等为靶标采用平板对峙法分析其拮抗谱，综合形态观察、生理生化测定和分子鑒定明确其分类地位，通过无菌滤液稳定性检测及抑菌代谢产物合成基因分析，初步推测抑菌物质为酯肽类抗生素，为苹果病原真菌生防制剂的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

HY-19分离自健康苹果植株根际土壤，烟台市林业科学研究所实验室保存。

1.2 病原指示菌

苹果斑点落叶病菌、苹果褐斑病菌、苹果圆斑病菌、苹果轮斑病菌由烟台市森林资源监测保护服务中心实验室保存，苹果轮纹病菌（Physalospora piricola Nose.）、苹果炭疽病菌[Colletorichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.]由烟台市农业科学研究院提供。

1.3 培养基

马铃薯胡萝卜培养基（PCDA） [11]用于病原菌的培养、保存;牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB）用于细菌液体发酵、培养;牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）用于细菌培养、保存。

1.4 菌株HY-19拮抗谱测定

采用平板对峙法 [12]测定菌株HY-19对病原菌的抑菌活性。采用菌丝生长速率法 [13]测定并计算菌株HY-19无菌滤液对病原菌的抑制率：用灭菌牙签将菌株HY-19接种到NB培养基上，30 ℃、200 r/min振荡培养48 h，菌液4 ℃，6 000 r/min 离心20 min，取上清液用0.22 μm微孔滤器过滤除菌后4 ℃保存备用。将病原菌接至滤液浓度为10%的PCDA平板中心，以不含滤液的PCDA平板为对照。计算各处理病原菌菌落直径及各拮抗菌株对病原菌的抑制率。抑制率=（对照组直径-试验组直径）/（对照组直径）×100%。

1.5 菌株HY-19的鉴定

1.5.1 形态与生理生化特征鉴定。

按照《常见细菌系统鉴定手册》 [14]和《伯杰氏细菌鉴定手册》 [15]的方法对HY-19进行形态鉴定及生理生化特征测定。

1.5.2 16S rDNA基因序列分析。

采用细菌16S rDNA 扩增通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对HY-19进行PCR扩增，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成DNA提取及测序工作。测序结果与 NCBI 数据库进行Blast核酸序列比对，利用 MEGA 5.0软件采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。

1.6 菌株HY-19无菌滤液稳定性检测

1.6.1 酸碱稳定性测定。

对无菌滤液进行pH梯度处理，pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10，室温处理3 h后，将各滤液调至pH = 7。以苹果斑点落叶病菌为病原指示菌，采用生长速率法分析抑菌物质的酸碱稳定性。

1.6.2 蛋白酶对抑菌物质的影响。

分别将蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶加入无菌滤液中配制成2 mg/mL溶液，37 ℃水浴2 h。以未经酶处理的滤液为对照，以苹果斑点落叶病菌为病原指示菌，采用生长速率法分析蛋白酶对抑菌物质的影响。

1.6.3 紫外辐射对抑菌物质的影响。

将无菌滤液置于紫外灯下分别照射0、2、4、6、8、10、12、24 h，以苹果斑点落叶病菌为病原指示菌，采用生长速率法研究紫外辐射对抑菌物质的影响。

1.7 菌株HY-19抑菌代谢产物合成基因检测

以菌株HY-19总DNA为模板，以细胞壁组分糖醛酸磷壁酸质合成基因为对照，用相应引物 [16]分别对丰原素（Fengycin）、杆菌溶素（Bacilysin）、表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）合成相关基因部分片段进行PCR扩增，检测菌株HY-19是否含有相应的抑菌代谢产物合成基因。

1.8 数据处理

利用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较及显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 菌株HY-19拮抗谱测定

菌株HY-19对不同病原菌具有不同程度的拮抗活性（图1），其中对苹果斑点落叶病菌、苹果圆斑病菌、苹果轮斑病菌的抑菌带宽度分别为2.62、2.41、1.15 cm，对苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、苹果褐斑病菌的抑菌带宽度分别为0.94、0.77、0.52 cm。菌丝生长速率法测定结果表明，菌株HY-19发酵滤液对苹果褐斑病菌、苹果斑点落叶病菌抑制率较高，分别为60.35%、58.62%，对苹果圆斑病菌、苹果轮斑病菌、苹果轮纹病菌的抑制率次之，对苹果炭疽病菌的抑制率最低，仅10.21%。

2.2 拮抗菌的鉴定

2.2.1 形态特征。

菌株HY-19在NA培养基上菌落近圆形，边缘平整，白色，表面光滑有光泽（图2a）;菌体短杆状，革兰氏阳性 [17]（图2b）。

2.2.2 生理生化鉴定。

该菌株为好氧菌，其需氧性、硝酸盐还原、明胶液化等测定为阳性反应，葡萄糖发酵、淀粉水解反应为阴性，具体生理生化鉴定结果见表1。

2.2.3 16S rDNA测序分析。

对菌株HY-19的16S rDNA基因片段进行PCR扩增，并对PCR产物测序，测序结果表明该区段的长度为1 444 bp，综合比对结果显示，菌株HY-19与短短芽孢杆菌[Brevibacillus brevis （AY887081.2）]的同源性最近且属同一分支（图3），结合形态特征、生理生化特性及分子鉴定，初步判断菌株HY-19为短短芽孢杆菌。

2.3 菌株HY-19无菌濾液稳定性检测

2.3.1 酸碱稳定性。

由图4可知，菌株HY-19发酵滤液在pH为7～9时抑菌活性保持在40%～58%，在pH为7时抑菌活性最强，达58%，在pH为3和10的强酸碱环境中也可保持20%以上的活性。这说明其耐酸碱稳定性较高，但在中性环境活性最高，在实际应用中宜保持中性环境。

2.3.2 蛋白酶对抑菌物质的影响。

分别用蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理HY-19发酵滤液后，与CK相比，其抑菌活性略有下降，但差异不显著（P<0.05），说明HY-19发酵滤液中可能不含或仅含少量蛋白类抑菌活性物质（图5）。

2.3.3 紫外辐射对抑菌物质的影响。

HY-19发酵滤液经紫外线处理后，对苹果斑点落叶病菌的抑制效果略有下降，但差异不显著（P<0.05），且抑菌率均在54%以上，说明紫外线对HY-19发酵滤液抑菌活性无显著影响（图6）。

2.4 菌株HY-19抑菌代谢产物合成基因检测

为了验证HY-19是否含有抑菌代谢产物合成基因，提取菌株全基因组后扩增丰原素、杆菌溶素、表面活性素、伊枯草菌素合成基因目的片段，结果表明（图7），4种脂肽类抗生素目的片段均能扩增成功，证明HY-19含有相应抑菌代谢产物的基因，具备产生相应抑菌代谢产物的能力，这些脂肽类抑菌代谢产物可能是HY-19发挥抑菌活性的关键因素。

3 结论与讨论

该研究以苹果褐斑病菌、苹果斑点落叶病菌为靶标，从苹果植株根际土壤分离纯化得到的菌株中筛选到1株拮抗菌株HY-19。该菌株对6种苹果病原菌具有不同程度的拮抗活性菌，对苹果褐斑病菌、苹果斑点落叶病菌抑制率较高，分别为60.35%、58.62%。 通过形态观察、生理生化测定及分子生物学鉴定，初步判定HY-19为短短芽孢杆菌（Bacillus brevis）。 HY-19无菌滤液对苹果斑点落叶病菌拮抗活性的酸碱稳定性、蛋白酶、抗紫外辐射表现良好。HY-19含有丰原素等4种抑菌代谢产物合成基因，推测HY-19发酵产生的脂肽类抗生素是其具有拮抗活性的主要原因。

短短芽孢杆菌为革兰氏阳性菌、严格好氧，可产生抗逆性内生孢子，广泛分布于土壤、淤泥、岩石等环境中 [18]，其产生的代谢产物包括多种类型，其中一些物质有明显的抑菌作用 [19]。这些抑菌物质主要包括由核糖体合成的抗菌蛋白、细菌素，由非核糖体合成的酯肽类物质或其他活性物质 [20]。其中酯肽类物质具有高效、稳定、广谱、安全无毒、无污染等特性，在农业、环保等多个领域有广泛的应用前景 [21]。魏新燕等 [22]研究发现，甲基营养性芽孢杆菌BH21的脂肽粗提物对灰霉菌菌丝生长抑制率可达73.9%。刘萍等 [23]研究表明，解淀粉芽孢杆菌产生的伊枯草菌素Bacillomycin D对金黄色葡萄球菌的生长具有显著抑制作用。董伟欣等 [24]证实丰原素在枯草芽孢杆菌 NCD-2对灰霉病菌的抑制作用中发挥主要功能。

目前苹果生产中对常见真菌性病害以化学防治为主，施药频次高，对环境及果品影响较大 [25]，因此，开发高效、广谱、稳定的微生物杀菌剂具有重要的现实意义。目前国内鲜见短短芽孢杆菌防治苹果早期落叶病的相关报道，该研究筛选出的HY-19对2种苹果主要病害的拮抗活性较高，具有一定的开发和应用价值。

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