玉竹多糖低共熔溶剂提取工艺优化及其抗氧化和抗糖基化活性研究

何瑞阳，王锋*，苏小军，李清明，杨华，朱晓慧，范宽秀，江雪梅

1(湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙，410128)2(湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南 长沙，410128) 3(湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙，410128)

玉竹(Polygonatumodoratum)为百合科黄精属玉竹的根茎，又名葳蕤、铃铛菜、尾参，是我国重要的药食同源大宗药材，具有滋阴润燥、生津止咳的功效。现代药理学研究表明，玉竹具有抗氧化、调节免疫力、降糖、降血压等作用[1]。玉竹含有丰富的多糖、黄酮、多酚等成分[2]，其中，多糖是其主要活性成分，在医药、食品、化妆品行业具有广阔的应用前景[3]。

低共熔溶剂(deep eutectic solvents, DESs)自ABBOTT等[4]2003年首次提出之后，由于其具有成本低、易合成、高溶解度、微毒甚至无毒等优点[5]，在生物活性成分提取领域受到广泛关注。其中，由氯化胆碱作为氢键受体(hydrogen-bond acceptor，HBA)与其他氢键供体(hydrogen-bond donor，HBD)组成的DESs在黄酮、多酚等生物活性物质的提取方面[3]研究较多。也有文献报道用于植物活性多糖的提取方面，如梁静[6]采用氯化胆碱与甘油组合DESs提取铁皮石斛多糖，提取率高达44.35%，显著高于传统提取方式。唐兰芳[7]采用氯化胆碱与1,4-丁二醇组合提取黄精多糖(Polygonatumsibiricunmpolysaccharide extracted by deep eutectic solvents， DPsP)，最终提取率可达33.81%，约为热水浸提法的4倍。DESs自身的极性、黏度等对多糖提取率起决定性作用；除此之外，提取过程中的温度、时间与液料比等也对多糖的提取率有影响[8]，所以在利用DESs提取植物活性多糖时，对提取条件进行优化以获得最优提取条件至关重要。

大多数关于玉竹的研究，均是热水提取[1]，鲜有采用DESs提取玉竹多糖(Polygonatumodoratumpolysaccharide extracted by deep eutectic solvents， DPoP)的研究报道。本研究采用DESs提取玉竹中的活性多糖，比较不同DESs组合，研究DESs摩尔比、DESs含水量、提取温度、提取时间、液料比等因素对多糖提取率的影响，通过响应面优化工艺参数，采用DPPH法、ABTS法、氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法对其进行抗氧化活性测定，并测定DPoP对糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)生成的抑制作用，旨在建立一种玉竹多糖的高效提取方法，并为玉竹多糖的开发利用提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉竹(品种：猪屎尾)，产自湖南郴州桂阳；葡萄糖(纯度≥99%)，上海麦克林生化科技有限公司；DPPH(纯度>97%)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；ABTS(纯度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ，纯度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司；氨基胍(纯度≥98%)，美国Sigma公司；乙醇(含量≥99.7%)，成都市科隆化学品有限公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)、无水葡糖糖、氯化胆碱、尿素、硫酸、甲醇等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；BJ-100型高速多功能粉碎机，德清拜杰电器有限公司；101A-3ET电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司；SCIENTZ-18 N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL16M冷冻离心机，长沙英泰仪器有限公司；RE-2000B旋转蒸发器，巩义市予华有限责任公司；SHZ-D(I)W循环水式多用真空泵，上海力辰邦西仪器科技有限公司；UV1901G/UV1901PCS紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；H-8数显恒温水浴锅，上海浦东物理光学仪器厂；VarioskanFlash多功能读数仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；IRAffinity-1傅立叶红外光谱仪，日本岛津有限公司；F-7000荧光分光光度计，日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

新鲜玉竹洗净、去须、切片，放入烘箱中，60 ℃烘干至水分含量10%以下，使用高速多功能粉碎机粉碎，过70目筛得玉竹粗粉，低温密封保存备用。

1.3.2 玉竹多糖提取

(1)热水浸提法(Polygonatumodoratumpolysaccharide extracted by hot water,HW)：根据《国家药典》第三部(2015版)，称取1 g玉竹粗粉置于圆底烧瓶内，加入蒸馏水100 mL，加热回流1 h，脱脂棉过滤，重复提取2次，滤液合并浓缩置100 mL容量瓶定容，得水提多糖溶液(HWPoP)。

(2)DESs提取法：称取1 g玉竹粗粉置于三角瓶中，以一定比例加入DESs，热水浴提取，提取结束冷却后加入4倍体积无水乙醇，4 ℃醇沉12 h后离心、复溶于100 mL蒸馏水，得DESs提取多糖溶液(DPoP)[9]。

1.3.3 玉竹多糖提取率计算

葡萄糖标准曲线制备：采用苯酚-硫酸法制作标准曲线，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为y=26.337x-0.003 9，R2=0.999 5。

按照1.3.2提取操作各重复3组，采用苯酚-硫酸法比对标准曲线测定多糖含量，按照公式(1)计算多糖提取率：

(1)

式中：C，通过标准曲线计算得多糖质量浓度，mg/mL；V，样品体积，mL；N，稀释倍数；m，称取玉竹粗粉质量，g。

1.3.4 不同组合DESs对玉竹多糖提取率的影响

以多糖提取率为指标，选取酰胺(尿素)、羧酸(丁二酸、柠檬酸)和多元醇(1,4-丁二醇、乙二醇)作HBD，氯化胆碱作HBA，以摩尔比2∶1的比例配成5种不同组合的均匀稳定的DESs溶液[10]，在温度90 ℃、液料比30∶1、提取时间40 min，按照1.3.2(2)提取方法提取玉竹多糖，并计算提取率。5种DESs组合见表1。

表1 DESs类型Table 1 Type of DESs

1.3.5 单因素实验设计

从1.3.4提取结果中选择提取率最高的DESs组合，在本实验室的研究基础上选取DESs摩尔比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)、提取温度(50、60、70、80、90、100 ℃)、提取时间(20、30、40、50、60、70 min)、溶剂含水量(0%、10%、20%、30%、40%、50%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)进行单因素考察，考察各因素对提取率的影响。

1.3.6 响应面优化实验设计

在单因素考察结果上固定DESs摩尔比，对提取温度(A)、提取时间(B)、溶剂含水量(C)、液料比(D)4个单因素进行响应面优化实验，以多糖提取率作响应值进行响应面Box-Behnken(BBD)分析，确定多糖提取最优条件组合。响应面实验因素与水平设计见表2。

表2 响应面实验因素与水平设计Table 2 Factors and level of Box-Behnken

1.3.7 DPoP制备

参照宗鑫妍等[1]的方法，采用Sevage试剂对1.3.2制备的DPoP溶液进行脱蛋白处理，并采用考马斯亮蓝法测定处理后溶液中可溶性蛋白含量。以BSA作对照，在吸光度595 nm处，以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制可溶性蛋白标准曲线，回归方程为y=5.162 9x+0.040 5，R2=0.999 2。重复脱蛋白操作直至上层多糖溶液中可溶性蛋白含量稳定。经脱蛋白处理的DPoP溶液浓缩至一定体积后加入4倍体积无水乙醇，4 ℃冷藏6 h后离心、冻干得DPoP粉末，将其低温贮藏备用。

1.3.8 DPoP红外光谱测定

取1 mg低温烘干的DPoP粉末，加入100 mg烘干至恒重的KBr，置研钵中研磨均匀，压片，在波数4 000～400 cm-1内进行红外扫描。

1.3.9 玉竹多糖抗氧化活性测定

DPPH自由基清除能力测定参照ZHAO等[11]的方法进行；ABTS阳离子自由基清除能力测定参照CHENG等[12]的方法进行；ORAC法参照ZAR等[13]的方法进行。

1.3.10 DPoP抗糖基化能力测定

参照张家成[14]的方法稍做改动，测定多糖的抗糖基化能力，配制20 mg/mL BSA溶液、0.5 mol/L葡萄糖溶液(glucose，Glu)，按照体积比1∶1混合过无菌滤膜，取3 mL BSA-Glu混合液，分别加入样品1 mL与6.0 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液，摇匀后避光37 ℃ 恒温孵育6 d，以氨基胍代替样品做对照组，磷酸缓冲溶液代替样品做空白对照，测定AGEs在激发波长370 nm，发射波长440 nm处的荧光值，玉竹多糖对AGEs的相对抑制率按公式(2)计算：

(2)

式中：Fc,空白组荧光值；Fs,样品组荧光值；Fs1,反应体系由缓冲溶液代替Glu样品的荧光值；Fs2,反应体系由缓冲溶液代替BSA样品的荧光值。

1.4 数据分析

所有操作均重复3次，实验数据采用“平均值±标准偏差”表示，采用SPSS 19 LSD法进行方差分析，P<0.05为差异显著，采用Origin 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同组合DESs对多糖提取率的影响

如图1所示，多糖提取率依次是UCC>EGCC>BCC>HW>AACC>CACC，尿素与氯化胆碱组合DESs对多糖的提取率显著高于其他组合，氯化胆碱与多元醇组合DESs提取率高于HW，氯化胆碱与羧酸组合DESs则低于HW，这与汪涛等[15]在提取DPsP时结果类似，引起提取效果差异的原因可能是不同DESs之间的扩散度、溶解度、黏度、极性等理化性质不同。实验确定以尿素与氯化胆碱组合做后续优化。

图1 不同组合DESs对多糖提取率的影响Fig.1 Effects of different types of DESs on the yield of polysaccharide 注：不同字母代表差异显著(P<0.05)，相同字母代表差异不显著

2.2 单因素试验结果

2.2.1 尿素与氯化胆碱摩尔比对提取率的影响

如图2所示，当尿素与氯化胆碱摩尔比开始增大时，多糖提取率呈现增长趋势，在3∶1时达到最大，超过3∶1之后，多糖提取率降低，这与尿素中的NH2基团与Cl-形成的氢键强弱对DESs的熔点与黏度造成的影响有关[16]，在摩尔比为5∶1时的提取率出现上升现象，而夏伯候等[17]在采用1,2-丙二醇与氯化胆碱组合提取夏枯草总黄酮时于摩尔比5∶1处也出现类似现象，具体原因有待进一步研究。本研究选择尿素与氯化胆碱摩尔比3∶1做后续优化。

图2 DESs摩尔比对多糖提取率的影响Fig.2 Effects of DESs molar ratio on the yield of polysaccharide

2.2.2 提取温度对提取率的影响

如图3所示，随着温度的升高，多糖提取率不断增大，当温度超过90 ℃以后多糖提取率呈现下降的趋势，可能是高温导致的多糖降解，温度对DESs的黏度、极性和物料的溶解度都会造成影响[18]，所以选择提取温度90 ℃做后续优化。

图3 提取温度对多糖提取率的影响Fig.3 Effects of temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3 提取时间对提取率的影响

如图4所示，随着提取时间延长提取率快速上升，在40 min时达到最大，提取时间超过40 min后提取率降低，在一定时间内，提取时间与活性成分溶出率成正比，超过40 min后可能出现多糖结构破坏降解，导致提取率降低，而在60 min时较50 min时的提取率略有升高，但不具有显著性(P>0.05)，可能是多糖继续溶出与结构破坏共同作用的结果。本研究选择提取时间40 min做后续优化。

图4 提取时间对多糖提取率的影响Fig.4 Effects of time the yield of polysaccharide

2.2.4 DESs含水量对提取率的影响

如图5所示，当DESs水分含量在0%～20%时，提取率随含水量增大而增大，在20%时达到最大，当含水量超过20%，提取率开始下降。含水量在30%～40%出现上升趋势，然而有趣的是宋歆睿[19]在采用低共熔溶剂提取蒲公英主要活性成分时，目标物的提取率在含水量为40%时较含水量30%时也有所上升，这可能是由于未结合的水降低了DESs的黏度与表面张力，提取率出现上升现象，而含水量继续增加导致分子间作用力降低，提取率迅速下降[20]。本研究选择DESs含水量20%做后续优化。

图5 DESs含水量对多糖提取率的影响Fig.5 Effects of DESs water content the yield of polysaccharide

2.2.5 液料比对提取率的影响

如图6所示，液料比在10∶1至30∶1时，溶剂量的增加，使得物料细胞与外界溶剂之间造成浓度差，浓度差增加更易使得植物细胞破碎，多糖提取率呈上升趋势，而当液料比超过30∶1时，过多的DESs可能使得物料之间相互作用减弱，不利于多糖提取，所以选择提取液料比30∶1做后续优化。

图6 液料比对多糖提取率的影响Fig.6 Effects of liquid-solid ratio on the yield of polysaccharide

2.3 响应面试验结果分析

根据2.2结果分析，固定尿素与氯化胆碱摩尔比为3∶1，选取提取时间、提取温度、DESs含水量与液料比作为单因素，选取多糖提取率为响应值，进行响应面优化实验，Box-Behnken实验设计与结果见表3。

2.3.1 回归方程模型与方差分析

采用Design-Expert 8.0对数据进行回归拟合分析，二次方程模型为Y=29.69+0.76A+0.46B-0.35C-0.36D-0.14AB-0.58AC+0.54AD+0.14BC-0.29BD+1.02CD-2.20A2-2.30B2-3.09C2-3.07D2。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Design and result Box-Behnken

根据表4结果分析，回归模型总回归系数R2=0.973 4，且模型P<0.01，实验模型达到极显著水平，模型方差失拟项P=0.492 6>0.05，说明该模型拟合度良好，可用于预测4种因素不同组合情况下多糖的提取率，模型变量A、B、CD、A2、B2、C2、D2均达极显著水平(P<0.000 1)，单因素变量C、D及相交变量AC均达显著水平(P<0.05)，各单因素在取值范围内，对玉竹多糖提取率影响大小顺序为：提取温度(A)>提取时间(B)>液料比(D)>溶剂含水量(C)。

2.3.2 响应面分析

通过Design-ExPert8.0对数据进行拟合得到响应面图，响应面的三维图与等高线图可以看出2个变量之间的相互作用，如图7-a所示，随着提取温度与含水量的增加，提取率呈现先增大后减小的趋势，等高线图密集且呈椭圆形，表明两变量相交对提取率影响极显著，如图7-b所示，随着含水量与液料比的增大，提取率呈现先增大后减小的趋势，等高线图呈椭圆形，证明两变量相交对提取率影响显著，如图7-c所示，随着提取温度与液料比的增大，提取率也呈现先增后减的趋势，三维图呈凸面，等高线图椭圆形，但相比图7-a，等高线较为稀疏，证明两变量相交对提取率有一定影响，这与方差分析结果一致。

表4 响应面结果分析Table 4 Analysis of Box-Behnken

2.3.3 回归模型验证实验

通过响应面优化分析，得到DESs提取玉竹多糖预测最优工艺条件为：提取温度91.73 ℃、提取时间40.97 min、溶剂含水量19.2%，液料比29.38∶1，预测多糖提取率为29.80%，为验证回归模型可信性，采取上述最佳操作条件进行提取实验，考虑到实际操作与仪器限制，将最终选取提取条件设为：摩尔比3∶1、提取温度92 ℃、提取时间41 min、溶剂含水量19%，液料比29∶1，在此优化条件下，多糖提取率为(29.03±0.54)%，与预测值接近，表明该实验回归模型可靠，能较为准确的预测玉竹多糖提取率。多糖提取率为热水浸提法(6.21±0.05)%的4.67倍。

2.4 玉竹多糖红外光谱测定结果分析

图8 DPoP红外光谱图Fig.8 FTIR of spectra of DPoP

2.5 DPoP对DPPH自由基清除能力

自由基由在人体内积累会引发某些慢性疾病，如动脉粥样硬化、神经病变、慢性抑郁症、癌症等。天然抗氧化剂能清除自由基且具有安全、健康等优点，受到人们广泛关注[23]，如图9所示，在测定质量浓度为2～20 mg/mL时，清除率随样品质量浓度的增大而增大，当质量浓度达到20 mg/mL时，清除率达到了(17.97±0.47)%，表明DPoP对DPPH自由基有一定的清除能力。经拟合，DPoP曲线方程为y=0.02x2+1.33x-1.98，R2=0.994，IC50=31.03 mg/mL。

图9 DPoP对DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH radical scavenging rate of DPoP

2.6 DPoP对ABTS阳离子自由基清除能力

ABTS阳离子自由基为稳定的有机自由基，在氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS阳离子，当抗氧化物存在时，ABTS的产生会被抑制。如图10所示，结果表明DPoP对ABTS阳离子自由基有一定的清除作用，且在测定浓度范围内DPoP对ABTS阳离子自由基的清除效果具有浓度依赖性，当质量浓度达到20 mg/mL时，清除率达到了(40.69±0.34)%，经拟合，DPoP曲线方程为y=0.01x3-0.34x2+5.22x+0.38，R2=0.998，IC50=23.25 mg/mL。综合图9和图10，DPoP虽然具有一定的清除DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的能力，但其清除作用均显著低于阳性对照维生素C，这可能是由于多糖的抗氧化机制与维生素C不同所致。多糖在体内是通过调节抗氧化酶的活性，利用抗氧化酶的还原作用将氧化物还原为低毒或无害的物质，从而达到清除自由基作用[24]，玉竹多糖抗氧化机理有待进一步深入研究。

图10 DPoP对ABTS阳离子自由基清除率Fig.10 ABTS cationic radical scavenging rate of DPoP

2.7 DPoP的ORAC值

ORAC值最接近真实的生理环境氧化过程，具有可操作性强、灵敏度高等优势而被广泛应用于食品功能性成分抗氧化测定方面[10]。以水溶性维生素E为对照组，经计算得玉竹多糖的ORAC值为(121.67±3.65) μmol/g，DPoP在ORAC法中表现出较强的抗氧化能力。唐兰芳[7]测定低共熔溶剂提取DPsP的ORAC值也达到(130.53±8.29) μmol/g，与DPoP的ORAC值相近；唐仕荣等[25]通过超声辅助提取枸杞多糖，测得枸杞多糖的ORAC值为78.34 μmol/g，显著低于DPoP的ORAC值。图11为对照组标准曲线。

图11 荧光衰退标准曲线Fig.11 Fluorescent decay standard curve

2.8 DPoP抗糖基化能力

AGEs是糖基化反应的终末端产生的对人体有害物质，与糖尿病、心脏病、肾衰竭和老年痴呆等许多疾病的发展有关[16]。如图12所示，DPoP对BSA-Glu体系中糖基化终末产物AGEs的抑制作用仅稍低于氨基胍，表现出很强的抗糖基化能力。在测定范围内，DPoP对AGEs相对抑制率呈线性增长，当DPoP质量浓度达到2.0 mg/mL时，抑制率达到(87.63±0.66)%，展示出良好的抑制效果，作为从食物资源中提取的天然成分，DPoP必将具备很好的应用前景。

图12 DPoP对AGES相对抑制率Fig.12 Relative inhibition rate of AGES of DPoP

3 结论

DESs提取玉竹中的活性多糖较热水有更强的溶出能力，工艺确定以尿素-氯化胆碱体系作溶剂，采取响应面优化设计，得到最优提取条件：在尿素-氯化胆碱摩尔比为3∶1，提取温度92 ℃、提取时间41 min、DESs含水量19%，液料比29∶1的条件下，玉竹多糖最终提取率可达(29.03±0.54)%，为热水浸提法的4.67倍。

通过红外光谱分析确定DPoP性质与糖苷键类型，DPoP为酸性多糖，存在β-吡喃糖苷键与α-吡喃糖苷键。DPoP抗氧化测定结果均表明,DPoP具有抗氧化能力，DPoP对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力随多糖质量浓度增大而增大，在质量浓度为20 mg/mL时，清除率分别达到(17.97±0.47)%、(40.69±0.34)%，ORAC值达到(121.67±3.65)μmol/g；糖基化终末端产物AGEs在体内积累是引发糖尿病的直接因素，抗糖基化结果表明，DPoP对AGEs的生成具有良好的抑制效果，当DPoP质量浓度达到2.0 mg/mL时，抑制率可达到(87.63±0.66)%，DPoP在新型降糖保健食品的开发方面有较大的应用潜力，有望进一步研究体内抗糖作用与机制以及进行相关功能性食品开发。