下颌发育不良及问号耳畸形患者的致病基因突变遗传分析

樊若溪，黎冬梅，章锦曼，朱宝生

(1.云南省第一人民医院 儿科，云南 昆明 650032；2.国家卫生健康委员会西部优生重点实验室，云南 昆明 650032；3.云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500)

0 引 言

耳髁突综合征(Auriculocondylar Syndrome，ACS；OMIM #614669, #602483, #615706)是一类以小下颌畸形和外耳廓畸形为主要特征的罕见的先天性颅面部出生缺陷.其典型的临床特征包括小颌畸形，下颌骨髁发育不全和特定外耳畸形[1-6].其中特定外耳畸形又被单独称为“问号耳畸形”(Question Mark Ears，QME)[7]，该畸形位于耳垂和耳轮的交界处，表现度从两者之间的切迹到分离为完整的裂隙不等.ACS非常罕见，目前在SCI数据库中收录的研究报道病例仅约为50例(包含单纯的问号耳畸形，Isolated Question Mark Ears，IQME，OMIM#612798)[8].ACS在不同家系的患者或同一家系中的不同成员之间，常常表现出高度的表型差异，临床表型非常多变[8-9].例如：同一家系有些成员只表现出单纯的问号耳畸形，或单纯的小颌畸形，此类情况有时也被诊断为Pierre Robin序列征(PRS，OMIM#261800)[8, 10-11].这些患者与家系中典型的ACS患者之间具有紧密的遗传相关性，因此，在分子遗传学研究中，一般将家系中的患者均归类为ACS不同程度的表型[12-13].近10余年来研究报道所收集的病例汇总统计，ACS患者除具有典型的特征外，常常还会伴有一些其他特征：ACS典型的圆脸脸颊，面颊突出，小口畸形，腭板畸形，舌后坠，咬合不正，牙列拥挤，听力损伤，呼吸困难，喂养困难等等[1, 6, 8, 14-16].

ACS于1978年首次报道并描述该疾病，该报道的家系患者具有双侧外耳发育不良及小颌畸形，研究提出该疾病为“一种新的综合征”[17].随后的一系列研究将该疾病定义为“耳髁突综合征”，并通过各家系患者的遗传模式分析，认为耳髁突综合征为常染色体显性遗传病[1, 10-11, 13, 18]，致病区域主要为染色体1p21.1-q23.3[10-11].2012年后，随着ACS在分子遗传学研究中取得进展和突破，逐渐确定了一条EDN1-EDNRA-DLX信号通路，该信号通路对于脊椎动物的咽弓发育和下颌骨分化起到至关重要的作用[19-23]，并发现除了常染色体显性的遗传模式，ACS同时还具有基因-表型对应的多种遗传模式并存的现象[8-9].

在EDN1-EDNRA-DLX信号通路中，内皮素1(EDN1)信号通过内皮素A受体(EDNRA)，调控Distalless homebox(DLX)转录因子在咽弓的表达，进而调控和影响脊椎动物的下颌骨分化发育[14, 20-23]；在一些ACS病例以及相关疾病动物模型中，发现EDN1-EDNRA-DLX信号通路的传导均遭到不同程度的破坏，EDN1以及作用于EDNRA下游的PLCB4，GNAI3均会影响该信号通路的传导[24-26].因此，ACS患者很可能是EDNRA介导的信号通路出现了问题[9]，该通路的保守性对于脊椎动物下颌的分化和发育起到至关重要的作用.

根据多个家系遗传模式的研究报道，EDN1的编码基因EDN1(Endothelin 1，OMIM#131240)，作用于EDNRA下游的PLCB4(Phospholipase C, β-4，OMIM#600810)和GNAI3(G protein, α-inhibiting 3，OMIM#139370).目前被认为是导致ACS表型的重要基因[9]，编码内皮素A受体EDNRA的EDNRA基因(Endothelin receptor type A，OMIM#131243)为“伴脱发的下颌面骨发育不全综合征(Mandibulofacial dysostosis with alopecia，MFDA，OMIM#616367)”的致病基因.目前发现，PLCB4基因通过常染色体显性或常染色体隐性的遗传模式均可导致ACS；GNAI3基因通过常染色体显性的遗传模式导致ACS[8]；EDN1基因通过常染色体隐形的模式导致ACS，或以常染色体显性的模式导致IQME，而EDNRA基因则以常染色体显性的遗传模式导致MFDA.由这些基因变异所导致的ACS患者之间表现出不完全外显率以及高度表型分化[8-9]，这一现象与临床发现的不同ACS患者具有不同程度的临床症状是相吻合的[10-11, 27]，可能与各种突变模式对信号传导造成不同的影响相关.

目前，由EDN1-EDNRA-DLX信号通路传导所导致的ACS致病机制研究尚浅，对于不同表型差异的遗传学背景仍需要更多病例和功能研究.

本研究对两组无亲缘关系且具有典型ACS特征的患者家系进行遗传学分析，结合已有的研究报道探索与患者致病相关的遗传学变异，为ACS的遗传学研究和临床诊断提供了重要的遗传学依据.

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 家系A病例资料

患者Ⅱ:3，女，24岁，白族，因“下颌发育不良”到医院接受遗传咨询，就诊者为Ⅱ:3本人，拒绝家系其他人接受检查(见图1)，拒绝公开相关影像资料.Ⅱ:3面貌呈现非常典型的ACS特征：下颌严重发育不良，小口畸形，圆脸脸颊，双侧耳廓与耳轮之间有明显切迹，呈“问号耳”特征.全景颅骨影像检查提示：受检者上下颌中线不齐，颏部右偏，右髁突形态较左侧欠规则，上颌前突，下颌发育不足，双侧生支短小，前牙覆盖较大.Ⅱ:3自诉平时睡觉打鼾严重，平素体健，无烟酒等不良嗜好，听力，智力正常，否认毒物放射性物质接触史，否认传染病、性病史、无手术及外伤史，否认近亲婚配及家族遗传病史，家族其他成员表型正常.

1.1.2 家系B病例资料

就诊家系成员包括患者Ⅱ:1，成员Ⅱ:2，患儿Ⅲ:1(见图2)，拒绝家系其他人接受检查，拒绝公开相关影像资料.先证者患儿Ⅲ:1，女，9月龄，汉族，因“下颌发育不良”到医院接受遗传咨询.Ⅲ:1容貌具有典型的ACS特征：下颌发育不良，小口畸形，圆脸脸颊，双侧耳廓与耳轮之间有明显切迹，呈“问号耳”特征，合并有心脏房间隔缺损.家属描述患儿Ⅲ:1平日喂养困难，吃奶时有呛奶，呼吸有不畅，喉间有“呼噜声”，平躺入睡偶有憋醒，侧卧和俯卧位能缓解.Ⅲ:1于3月龄时到外院就诊并以“皮-罗综合征”收治入院，行专科检查结果：轻度营养不良，皮下脂肪菲薄，下颌发育小且后缩，呈鸟嘴状，上颚部悬雍垂及软颚部裂开，最宽约1.0cm，未及硬腭及牙槽裂，舌系带短.行“头颅+面部、气管及支气管CT扫描”提示：小下颌畸形，下颌骨短小，内收，双侧颞下颌关节在位，软硬腭均可见，舌根后坠，局部气道略窄；颅内CT平扫未见明显异常；两肺纹理增多、增粗；气管支气管重建未见明显异常.行心脏彩超检查提示房间隔缺损及二尖瓣、三尖瓣收缩期各见少量返流.住院行“下颌延长器置入术+异体骨置入术”手术，手术顺利并于25天后出院.

患者Ⅱ:1，37岁，汉族，容貌特征表现为轻微的下颌骨后缩，下颌发育比常人略小略短(短颌)，耳轮和耳垂间有轻微切迹，临床表型有轻微ACS特征.自述其母亲Ⅰ:2具有与Ⅱ:1本人相似的短颌表型，二人均未进行过专科医学检查.平素体健，无不良嗜好，否认毒物放射性物质接触史、传染病、性病史，手术及外伤史，否认其他家族遗传病史.

图1 ACS患者家系A示意图Fig.1 Patient family A with auriculocondylar syndrome (ACS)

图2 ACS患者家系B示意图Fig.2 Patient family B with auriculocondylar syndrome (ACS)

1.2 研究方法

对受检者进行染色体，CNV片段到基因位点突变三个层面的遗传学检测，结合已有的研究报道，分析检测数据.家系A患者Ⅱ:3经本人知情同意，接受染色体核型分析，高通量测序染色体拷贝数变异检测(Copy Number Variations，CNVs)和全外显子组检测.家系B三人(Ⅱ:1，Ⅱ:2，Ⅲ:1)经本人和家属知情同意，Ⅲ:1接受染色体核型分析、CNVs检测，并对三人都进行了家系全外显子组检测.本研究遵循的程序符合本院医学伦理委员会所制定的伦理学标准，得到了该委员会批准，同时征得受检者本人或家属的知情同意，并与之签署了临床研究知情同意书.受检者愿意提供相关的临床检查资料，但拒绝公开相关的影像资料.

1.2.1 标本的采集及处理

抽取每位受检者3～5 mL 外周血，用于提取DNA待用.DNA的提取采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒(QIAgen，Germany)进行，实验操作严格执行试剂盒说明书操作流程，提取的DNA经质检合格，定量后于 4 ℃ 待用或 -20 ℃ 保存

1.2.2 染色体核型分析

染色体核型分析依照本实验室常规流程完成，分析使用全自动染色体图像分析仪(英国AI Cytovision公司产品)显微照相，按照人类细胞遗传学命名国际体系(ISCN，2005)对受检者染色体核型进行分析和命名.

1.2.3 高通量测序染色体拷贝数变异检测(Copy Number Variations，CNVs)

高通量测序染色体拷贝数变异检测(CNVs)依照本实验室常规流程完成，检测使用DA8600测序仪(中山大学达安基因股份有限公司)，采用新一代高通量测序技术，结合生物信息学分析，检测全基因组范围内微小片段拷贝数变化，是一种快速、高效的分子核型分析技术.

1.2.4 全外显子组测序(Whole Exome Sequencing, WES)

将每位受检者总量约 2 μg 的总DNA样品运送至北京安诺优达公司进行全外显子组测序，采用Agilent Sure Select Human All Exon V6 外显子靶向序列富集系统进行外显子序列捕获，经过DNA样品质检和Exon文库制备等标准流程后，通过Illumina HiSeq测序平台上进行测序.测序信息经过信息分析，数据处理、比对、质控、变异检测注释后，提交样本的变异位点、SNP、InDel、SV、CNV以及融合基因数据.参考基因组以UCSC hg19作为参考序列，平均测序深度约100×.

1.2.5 候选突变位点的Sanger测序验证

对候选基因的突变位点进行Sanger双向测序验证，以保证变异位点信息的准确性.位点验证按本实验室常规流程完成，依据UCSC hg19参考序列设计PCR扩增引物及测序引物后，通过PCR扩增、回收及纯化，使用Bigdye试剂盒完成测序反应，经ABI 3730 DNA Analyzer DNA 测序仪完成Sanger测序，并进行位点检测.

图3 PLCB4基因纯合错义突变c.991T>C(p.Y331H)测序结果Fig.3 Identification of homozygous missense mutation c.991T>C (p.Y331H) in PLCB4

2 结 果

2.1 家系A患者Ⅱ:3遗传检测结果

2.1.1 家系A患者Ⅱ:3染色体核型分析及CNVs检测结果

患者Ⅱ:3染色体核型分析结果未检出G带染色体组型400条带水平明显异常.CNVs检测检出受检者5q21.1(chr5: 99,250,401-99,600,024)区域微缺失；Xq27.2(chrX: 140,349,890-140,700,319)区域微重复.通过DECIPHER数据库检索，该区域并未查找到有明确已知或疑似致病相关的报道.

2.1.2 患者Ⅱ:3全外显子组检测结果和验证

经过对Ⅱ:3全外显子组测序数据进行分析，结合已有的研究报道，筛选并寻找到PLCB4基因上发生纯合错义突变(Chr20: 9364985; NM_000933; exon11; c.991T>C; p.Y331H)，突变位点经过Sanger双向测序验证无误(见图3).PLCB4基因经报道为ACS的致病基因(OMIM#600810)，已知可通过常染色体显性和常染色体隐形遗传模式致病，尚未检索到与c.991T>C/p.Y331H位点相关的报道.

2.2 家系B遗传检测结果

2.2.1 患儿Ⅲ:1染色体核型分析及CNVs检测结果

Ⅲ:1染色体核型分析未检出G带染色体组型400条带水平有明显异常.CNVs分析检测未检出染色体非整倍体异常和已知的、致病性明确的 100 Kb 以上的微缺失/微重复变异.

患者Ⅱ:1，携带杂合移码突变c.811_812insT(p.T271fs)； 正常成员Ⅱ:2，未检测到突变c.811_812insT(p.T271fs)； 患者Ⅲ:1，携带杂合移码突变c.811_812insT(p.T271fs)图4 EDNRA基因杂合移码突变测序结果 Fig.4 Identification of heterozygous frameshift mutation c.811_812insT (p.T271fs) in EDNRA The variant was identified in patients II: 1 and III: 1, and was not detected in other member II: 2

2.2.2 家系B受检者全外显子组检测结果

对家系B的三位受检者全外显子组数据进行分析，结合已有的研究报道，在患者Ⅲ:1及Ⅱ:1中发现EDNRA基因发生杂合单碱基插入所造成的移码突变(Chr4: 148457092; NM_001957; exon5; c.811_812insT; p.T271fs)，突变位点经Sanger双向测序验证无误(见图4)，Ⅱ:2未检测到疑似致病相关的变异.EDNRA基因(OMIM#131243)经报道为“伴脱发的下颌面骨发育不全综合征(Mandibulofacial dysostosis with alopecia，MFDA，OMIM#616367)”的致病基因；通过常染色体显性遗传，尚未有c.811_812insT/p.T271fs位点相关的研究报道.该家系在已关联ACS的基因(PLCB4、GNAI3和EDN1)上未找到符合遗传规律且有致病倾向的变异位点.

3 讨 论

3.1 家系A患者Ⅱ:3的突变分析

家系A患者Ⅱ:3临床症状与ACS表型高度相符，包括典型的小颌畸形，下颌骨髁发育不全和问号耳畸形，同时还包括小口畸形，上下颌中线不齐，颏部右偏，以及ACS典型的圆脸脸颊等.

Ⅱ:3在PLCB4基因上找到纯合错义突变(Chr20: 9364985; NM_000933; exon11; c.991T>C; p.Y331H).Y331H突变通过1000 Genomes、ExAC、dbSNP、OMIM等常见重要的公共数据库注释后，未发现该突变在人群中的突变率等相关数据和研究报道，该突变不属于人类群体中的多态性位点.由于未能对患者父母进行验证，未证实该突变为患者的新发突变还是由源自父母携带的突变.

PLCB4基因位于人类20号染色体，编码 1 194 个氨基酸，包含36个外显子，3个蛋白功能域，在细胞中定位于细胞质、内质网及细胞核.PLCB4基因编码1-磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯酶，可催化肌醇-4，5-二磷酸与水生成二酰基甘油(DAG)和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)，DAG和IP3是细胞内重要的第二信使分子，通过激活特异的磷脂酰肌醇磷脂酶C来发挥功能，在细胞内脂代谢调控中发挥重要作用[28].

Y331H突变发生于PLCB4基因第11个外显子，第一个PI-PLC X-box结构域，导致酪氨酸替换为组氨酸.使用dbNSFP数据库进行非同义突变注释，评估氨基酸的保守性以及致病性，该突变的SIFT、Polyphen2_HDIV及Polyphen2_HVAR的评估预测分类均提示为“有害突变”.该突变很可能改变蛋白质结构域功能，破坏产物的活性.

据前文所述，PLCB4和GNAI3基因编码的产物作用于EDNRA下游，该基因上发生的致病突变会导致产物功能丧失造成单倍型剂量不足，或是错义突变的合成产物会抑制或阻断野生型蛋白质正常的合成和功能行使，从而在发育过程中对该通路的信号传导产生负效应，导致ACS表型发生[8, 9, 24].本病例所携带的突变的致病性评估与ACS的相关报道相符.PLCB4基因(Chr20: 9364985; NM_000933; exon11; c.991T>C; p.Y331H)突变极有可能为该患者ACS表型的致病突变.

3.2 家系B患者的的突变分析

患儿Ⅲ:1的临床症状与ACS表型高度相符，具有ACS典型的小颌畸形，下颌发育不全，双侧耳廓与耳轮之间有明显切迹，呈现“问号耳”特征，同时还包括小口畸形，舌后坠以及圆脸脸颊.其父Ⅱ:1容貌表现为较轻微的下颌骨内收，下颌比常人略短(短颌)，耳轮和耳垂间有轻微切迹，有轻微的ACS特征.

家系B三人通过全外显子组检测，在Ⅲ:1与Ⅱ:1的EDNRA基因中均找到杂合单碱基插入造成的移码突变(Chr4: 148457092; NM_001957; exon5; c.811_812insT; p.T271fs).经过1000 Genomes、ExAC、dbSNP、OMIM等常见重要的公共数据库注释，未发现T271fs在人群中突变率等相关数据和研究报道，该突变不属于人群多态性位点.Ⅲ:1的突变来源于其父Ⅱ:1，未能对Ⅱ:1的父母(Ⅰ:1,Ⅰ:2)进行验证.

EDNRA基因(内皮素A受体，Endothelin Receptor Type A)位于4号染色体，包含8个外显子，编码427个氨基酸，是一种细胞定位于细胞膜上，具有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体，EDNRA在EDN1-EDNRA-DLX信号通路中与配体EDN1结合，通过在第一咽弓的表达[19, 29]，对第一二咽弓的发育起到至关重要的作用，进而影响上颌和下颌的正常发育[13].

T271fs突变是位于EDNRA基因第5外显子区的单碱基杂合插入，该插入位于EDNRA转录产物的第5跨膜区，并导致转录在第281个氨基酸处提前终止，使得编码蛋白质提前终止，其后的两个跨膜结构无法形成，可能极大地影响了EDNRA受体的功能，并导致内皮素受体-配体结合的亲和性发生改变，对EDN1-EDNRA-DLX的信号传导产生负效应，从而致使患者发病.

已有的研究报道在“伴脱发的下颌面骨发育不全综合征(Mandibulofacial dysostosis with alopecia，MFDA，OMIM#616367)”的患者中发现EDNRA基因的错义突变，并证实EDNRA为该疾病的致病基因，常染色体显性遗传模式[30].该疾病的主要特征主要表现为颧骨和下颌发育不全，伴随有眼睑和耳朵发育异常，并伴有脱发症状.该研究虽然未将MFDA直接归类到ACS，但是其核心的临床表型与ACS的临床表型具有高度的相似性(下颌发育不良及外耳畸形)，且致病基因EDNRA在EDN1-EDNRA-DLX信号通路的传导中起到至关重要的作用，对表型的影响指向与人类的下颌骨发育与耳廓畸形紧密相关.

在本研究中，患者Ⅲ:1与Ⅱ:1虽未表现出脱发症状，然而家系祖孙三代(Ⅰ:2，Ⅱ:1和Ⅲ:1)均具有不同程度的下颌发育不良及外耳畸形，呈现出典型的遗传病倾向和ACS特征.该家系在已报道的ACS致病基因(PLCB4、GNAI3和EDN1)中未发现有符合遗传规律且有致病倾向的变异位点.因此，EDNRA基因的T271fs杂合突变极有可能导致了家系B临床表型缺陷，其个体表型的差异符合ACS患者表型的不完全外显以及高度临床表型分化的特点.这一结果提示EDNRA基因缺陷可能不止导致MFDA发生，同样可能与ACS的致病性具有高度相关性，其作用机制需要进一步的功能试验进行深入分析.本家系病例进一步证明了EDNRA在信号通路传导中的精准调控对于人类颅面发育的重要性，内皮素受体-配体的特异性修饰在脊椎动物颌骨发育过程中具有至关重要的作用.

4 结 论

以ACS为代表的下颌发育不良及问号耳畸形是一类有较强表型相关性的遗传综合征.该类疾病发病率低，个体临床表型差异大，遗传模式复杂多样，目前SCI仅收录约50例ACS研究病例，病例数目和研究重视程度都远远不足.虽然已有的研究已经通过斑马鱼等动物模型数据证实了EDN1-EDNRA-DLX信号通路相关基因对于ACS致病具有重要的影响，然而尚未能发现致病基因的基因型与表型特征和表现度的关联性.该信号通路各个基因所具有的不同的遗传模式，以及家系内或无亲缘关系的成员之间高度的表型差异，其作用机制研究尚不清晰，仍需要通过更多病例及更深入的功能实验进行探索.本研究通过对两个具有ACS临床表型的家系进行全外显子组高通量测序，分别在两个相关基因中发现了未报道过的疑似致病突变PLCB4(Chr20: 9364985; NM_000933; exon11; c.991T>C; p.Y331H)及EDNRA(Chr4: 148457092; NM_001957; exon5; c.811_812insT; p.T271fs)，提示EDNRA基因缺陷同样可能与ACS的临床特征相关.该研究为探索人类下颌骨发育的致病因素和作用机制提供了重要的病例和遗传学数据，进一步证明了EDN1-EDNRA-DLX信号通路在人类下颌骨发育过程中的重要作用，同时为两个家系疾病的明确诊断提供了重要的遗传学依据.