基于生物信息技术探究藿香正气液治疗COVID-19的机制

顾昱昊,陈可点,戚 蕊,卢明军,皮雯敏,谢以清,高 丰,戴子琦,吴倩文,霍 苏,徐 意,徐 冰*,雷海民*

1.北京中医药大学,北京 100102;2.北京同仁堂科技发展股份有限公司,北京 100062

新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 19,COVID-19）属于中医学“疫病”的范畴,多数学者认为其病位在肺和脾[1-2]。藿香正气方出自《太平惠民和剂局方》,涉及苍术、陈皮、厚朴、白芷、茯苓、大腹皮、半夏、甘草、广藿香、紫苏和生姜11味中药,具有解表化湿、理气和中的功效。针对COVID-19 患者常伴随消化道症状的情况[3],藿香正气水作为《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中推荐的中成药,其治疗机制引起研究者的关注[4-6]。

基于三维整体观探究中药多成分、多靶点、多通路协作机制的生物信息技术,具有降低药物研发成本、指导临床精准用药的独特优势[7-11]。本研究采用生物信息技术构建藿香正气液的可视化网络,解析藿香正气液在治疗COVID-19 方面的活性成分、作用靶标、生物学机制,以期阐明其治疗COVID-19的效应机制。

1 资料与方法

1.1 数据库

数据库信息见表1。

表1 数据库信息Tab.1 Database information

1.2 筛选药效物质基准

登录TCMSP,以DL≥0.18、OB≥30%为标准筛选11味药材的有效成分,进入Sym Map数据库核对并导出归经信息。

1.3 潜在靶点的预测与筛选

将筛选出的药材有效成分输入Pharm Mapper数据库、DrugBank数据库和Swiss Target数据库,获得相应靶点信息,并应用Uniprot数据库对其进行标准化处理。将经标准化处理的数据与从Genecards数据库筛选出的COVID-19靶点基因进行映射。

1.4 构建多水平网络系统

1.4.1 PPI网络构建 将映射所得的靶点基因输入STRING 数据库,设定物种,简化游离蛋白,规定相互作用评分为0.9,形成关系网络。

1.4.2 网络建模 将归经-中药-化合物-靶点-疾病的关系在Cytoscape 3.7.1信息处理的基础上以网络图的形式呈现。

1.5 通路阐述

在DAVID 数据库中分析靶点所处通路,得出筛选结果。

1.6 分子对接

在RCSB 蛋白数据库中选取最高分辨率的血管紧张素转化酶Ⅱ（angiotensin converting enzyme 2,ACE2）蛋白结构,用Pymol软件进行预处理;运行AutoDock Tolls 4.2.6 为受体分子加极性氢。将小分子以“mol2”格式导入AutoDock Tolls 4.2.6并导出PDBQT 文件,经过处理的小分子与靶点在AutoDock 4.2.6通过计算晶格能量完成分子对接。

2 结果

2.1 物质基准的筛选

经TCMSP平台初步筛选,获得关键化合物164种。

2.2 潜在治疗靶点基因的预测

将从TCMSP平台所得的信息以“mol2”的格式导 入Pharm Mapper数据库、DrugBank数据库、Swiss Target数据库,获得3 359个靶标信息,经去除重复,剩余443个关键化合物靶标信息组成数据库,用Uniprot进行基因名称的标准化核对与校准。在Genecards数据库输入“COVID-19”,获得基因192个,将藿香正气液与COVID-19 的靶点基因进行映射,得到潜在治疗靶点67个。结果见表2。

表2 藿香正气液-COVID-19的潜在治疗靶点基因Tab.2 Potential therapeutic target genes of HXZQ-COVID-19

2.3 PPI网络构建

将潜在治疗靶点导入STRING 平台,研究物种选择“人类”,筛选评分＞0.9的蛋白关系,获得关键靶点。结果见图1。

图1 藿香正气液治疗COVID-19的重要靶点Fig.1 Core targets of HXZQ in the treatment of COVID-19

2.4 网络成像

将以上药物活性成分、潜在治疗靶点、药物和疾病的名称导入Cytoscape 3.7.1 软件,绘制网络图,见图2。通过cyto Hubba 基于度（degree）、紧密度（closeness）和中介性（betweenness）筛选均大于平均值（分别为14.05、91.48、343.45）且排名靠前的节点。重要节点有槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（βsitosterol）、柚皮素（naringenin）、汉黄芩素（wogonin）、山柰酚（kaempferol）、2-hydroxyisoxypropyl-3-hydroxy-7-isopentene-2,3-dihydrobenzofuran-5-carboxylic和甘乌内酯（glyuranolide）。

图2 归经-中药-成分-靶点-疾病网络图Fig.2 Network diagram of channel tropism-traditional Chinese medicine-composition-target-disease

2.5 通路分析

获得173个GO 项目（P＜0.05）,涉及生物过程（biological process,BP）项目126 个,细胞组成（cellular component,CC）项目22个,分子功能（molecular function,MF）项目25 个,分别占72%、13%、15%。结果见表3、表4和表5,未满足20条通路的功能选取其所有通路。KEGG 通路富集筛选得到114条信号通路（P＜0.05）,根据P值由小到大筛选排名前20的通路。结果见表6。

表3 （续） 藿香正气液潜在靶标的生物过程富集分析Tab.3 （Continued）GO pathway enrichment analysis for biological process of candidate targets of active compounds in HXZQ

表5 （续） 藿香正气液潜在靶标的细胞组成富集分析Tab.5 （Continued）GO pathway enrichment analysis for cellular component of candidate targets of active compounds in HXZQ

表6 藿香正气液潜在靶标的KEGG 通路富集分析Tab.6 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active compounds in HXZQ

2.6 分子对接结果

最低结合能越低,表示与小分子的结合能力越强,结果见表7。由表7可见,β-谷甾醇、甘乌内酯与ACE2具有自发的亲和力。

表7 关键靶点与关键化合物的对接结果Tab.7 Docking results of key targets and key compounds

3 讨论

本研究通过可视化网络分析,筛选出藿香正气液中各药物的归经及其治疗COVID-19的7种潜在活性成分,其归经度值排名与疾病病位一一印证。其潜在活性成分分别为槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、汉黄芩素、山柰酚、2-hydroxyisoxypropyl-3-hydroxy-7-isopentene-2,3-dihydrobenzofuran-5-carboxylic和甘乌内酯。其中槲皮素和汉黄芩素等来源于君药藿香和臣药陈皮、佐药苍术,印证了临床上相须为用的中药配伍原理。已有研究探索了槲皮素、β-谷甾醇治疗COVID-19的机制[9-13],而2-hydroxyisoxypropyl-3-hydroxy-7-isopentene-2,3-dihydrobenzofuran-5-carboxylic、甘乌内酯的抗病毒活性则是由本文首次报道。

通过PPI筛选发现MAPK1、MAPK3和Rel A 等是藿香正气液治疗COVID-19的关键靶点。据报道,MAPK1是COVID-19引起的严重肺损伤的关键调节剂,同时能够调节炎症因子的表达以延缓肺纤维化,控制气管分泌物的生成[14-18]。Rel A 又称NF-κB3,是机体发生抗病毒先天性免疫应答反应的重要信号因子,在气道性炎症、肺损伤等疾病中被激活并通过NF-κB/MAPK信号通路引起下游炎症介质的过表达[19-22]。

通过解析GO 富集分析结果可知,BP 主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ转录的正调控、炎症反应等。由于新型冠状病毒RNA 的重组率非常高,故以RNA 聚合酶为靶点开发抗新型冠状病毒抑制剂成为当下研究的热点,同时这也被认为是中药潜在的治疗作用机制[23-25]。研究表明,COVID-19会伴随剧烈的细胞因子风暴[26],细胞因子风暴引发的炎症反应进一步造成严重的二次损伤。

解析KEGG 分析结果可知,缺氧诱导因子-1信号通路、鞘脂信号通路和肿瘤坏死因子信号通路等与藿香正气液对COVID-19 治疗作用的相关度较高。缺氧是COVID-19 患者常见的临床表现,调控缺氧诱导因子-1 信号通路中的HIF-1 能够通过调节免疫、促进炎症反应、诱导新生血管形成及生长等,引发气道炎症和气道重塑[27]。鞘脂信号通路与肺纤维化的发生息息相关[28],其中S1P 还参与诱导气道重塑和气道平滑肌收缩[29]。肿瘤坏死因子信号通路中的TNF-α能够通过下调MAPK、ERK 和NF-κB 等,从而抑制细胞凋亡,减轻肺部炎症反应[30-31]。

分子对接结果显示,所有关键化合物与ACE2、MAPK1和MAPK3的结合能均小于-5.0 kJ·mol-1,此外存在于半夏、生姜、白芷、紫苏中的β-谷甾醇与存在于甘草中的甘乌内酯,不仅能与COVID-19入侵人体的关键靶点ACE2 结合形成稳定构象,此外还与COVID-19 所致肺损伤的关键靶点 MAPK1 和MAPK3具有最强的亲和力。

由于受限于数据库信息差异性等问题,该研究的结果不可避免地存在一定偏差,该研究的结果将为后期的实验研究提供参考。