一株虹鳟源枯草芽孢杆菌产胞外蛋白发酵条件优化

樊 丹，邓福容，李绍戊，卢彤岩，刘红柏，王 荻*

（1.中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070；3.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；4.上海海洋大学 国家水生动物病原库，上海 201306）

【研究意义】虹鳟（Oncorhynchus mykiss）是我国重要的淡水冷水鱼养殖品种，具有体色艳丽、肉质细嫩、味道鲜美、无肌间刺等优点，深受广大垂钓爱好者和消费者青睐，其养殖产业拥有良好的发展和市场前景[1]。随着市场需求量的不断增大，高密度集约化人工养殖技术得到了快速发展，但由于科学管理手段的滞后引发了诸如水质环境恶化、密度胁迫、营养失衡等问题，导致养殖过程中细菌性疾病频发。目前抗生素的使用仍是虹鳟养殖过程中细菌性病害防治最为有效的方式[2]，而抗生素不规范不科学使用导致的细菌耐药、养殖环境及生态环境恶化等问题日益突出，对环境安全及食品健康造成了潜在危害和影响[3-5]。益生菌不仅具有促进宿主生长、增强免疫的功能，且能有效抑制条件致病菌生长，降低病害发生频率及危害，作为新型生防剂或饲料添加剂在畜牧、水产养殖中具有较好的应用效果和发展前景[6-10]。水产常用益生菌包含酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌等[9,11-12]，而芽孢杆菌中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种需氧型革兰氏阳性菌，具有抗逆性能强，耐强酸强碱高盐[13-14]，可产蛋白酶、纤维素酶等消化酶促进宿主消化吸收等功能[15-16]。【前人研究进展】研究表明枯草芽孢杆菌能产生抗菌蛋白，其分子质量通常大于10 ku，对苹果树腐烂病菌（Valsa mali）[17]、大肠杆菌（Escherichia coli）[18]、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）[19]、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[20]等致病菌具有拮抗作用。此类物质一般具有热稳定性，酸碱稳定性，紫外线稳定性，抑菌谱广，对蛋白酶不敏感，对生态安全无危害等特点[17-21]；可引起病原菌细胞壁几丁质积累、细胞膜透性发生改变和DNA 降解[22-23]，达到抑制病原菌的作用。【本研究切入点及拟解决的关键问题】试验对虹鳟源枯草芽孢杆菌RT-BS07 益生菌候选株产胞外蛋白发酵条件进行了优化，并对其胞外蛋白的抗菌性能进行检测。为该菌株在今后的抗菌及生物防治等方面的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用枯草芽孢杆菌RT-BS07 株分离自辽宁省本溪艾格莫林实业有限公司的健康虹鳟肠道内，前期试验结果表明该菌株具有耐酸碱耐高温、显著促虹鳟体质量增长，安全性能良好等特点，可作为益生菌候选株进行进一步深入研究；温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）、维氏气单胞菌（A.veronil）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila）和鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）为本实验室鉴定保存菌株；胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司；氯化钠购自阿拉丁公司；BCA蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所；分光光度计购自Thermo公司。

LB 液体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、去离子水定容至1 L，用1 mol/L NaOH溶液调节培养基pH值至7.0，121 ℃灭菌15 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株种子液的制备 取冻存的枯草芽孢杆菌RT-BS07株划线接种于LB琼脂平板上，28 ℃倒置培养24 h复苏。挑取单菌落接种于10 mL LB 液体培养基中，28 ℃、120 r/min 振荡培养24 h后，得到种子培养液。

1.2.2 胞外蛋白粗提液的制备 将培养好的种子液按1%的接种量接入LB 液体培养基，28 ℃，120 r/min振荡培养24 h。发酵液于4 ℃，12 000 r/min 离心5 min，经滤器（孔径0.22µm）过滤后，收集上清液，获得胞外蛋白粗提液[17]。

1.2.3 蛋白浓度测定 按照BCA 试剂盒说明书操作，利用Thermo分光光度计的BCA 程序直接测定胞外蛋白浓度。

1.2.4 发酵工艺优化单因素试验 选取影响菌株发酵的5 个因素：盐度、摇床转速、培养时间、培养温度和培养基初始pH 值[24-25]，进行单因素试验，考察各因素对蛋白浓度的影响，从而确定正交试验的因素及水平。每个试验处理设置3 次重复，不同因素的梯度条件见表1。单一变量下其他因素保持不变，常规设定盐度1%、初始pH值7.0，摇床转速120 r/min、28 ℃下培养24 h。

表1 单因素试验水平设计Tab.1 Design for single factor

1.2.5 正交设计 基于单因素试验结果，采用正交组合试验设计方案，以盐度（%）、摇床转速（r/min）、培养时间（h）、培养温度（℃）和初始pH值为自变量因素，以胞外蛋白浓度为评判标准。自变量分别用A、B、C、D、E表示，变量水平表示为1、2、3。

表2 正交试验因素及水平设计Tab.2 Design for orthogonal test factors and horizontal

1.2.6 胞外蛋白抑菌实验 参照李琪敏等[7]的研究方法并改进，将鲁氏耶尔森菌等5 种条件致病菌培养12 h的100µL 菌悬液涂布于LB 固体培养基表面，晾干后牛津杯打孔。取正交试验蛋白浓度最高的3份胞外蛋白粗提液与优化条件培养的胞外蛋白粗提液各100µL添加至牛津孔内，以无菌PBS为阴性对照，于28 ℃培养18 h 后利用十字交叉法测量抑菌圈直径并计算抑菌面积，每孔设置3 个重复。抑菌面积计算公式为S=¼πab-πr2。a、b表示抑菌圈的最大直径；r表示牛津杯孔外径的半径。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS Statistics 26.0软件进行处理分析。

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 盐度对胞外蛋白浓度的影响 随着盐度升高，胞外蛋白浓度逐渐降低。当培养基盐度为1.0%时，蛋白浓度为（12.74±0.26）mg/mL，显著高于其他盐度下的结果（表3）。

表3 不同盐度对胞外蛋白浓度的影响Tab.3 Effect of salinity on crude protein concentration

2.1.2 摇床转速对胞外蛋白浓度的影响 随着摇床转速升高，胞外蛋白浓度呈现先升高而后逐渐降低的趋势。当摇床转速为150 r/min时，蛋白浓度达到峰值（21.42±0.39）mg/mL，显著高于其他转速组（表4）。

表4 摇床转速对胞外蛋白浓度的影响Tab.4 Effect of speed on extracellular protein concentration

2.1.3 培养时间对胞外蛋白浓度的影响 随着菌液发酵时间的增加，胞外蛋白浓度呈现逐渐升高趋势。当发酵时间为48 h 时，蛋白浓度为（14.86±0.17）mg/mL，显著高于其他发酵时间组。培养72 h 后，虽然获得了较高浓度的蛋白液，但培养物有强烈的刺鼻性气味（表5）。

表5 培养时间对胞外蛋白浓度的影响Tab.5 Effect of incubation time on extracellular protein concentration

2.1.4 培养温度对胞外蛋白浓度的影响 随着培养温度升高，蛋白浓度呈现先升高后降低的趋势。当培养温度为28 ℃时，蛋白浓度为（15.63±0.67）mg/mL，显著高于其他温度（表6）。

表6 培养温度对胞外蛋白浓度的影响Tab.6 Effect of temperature on extracellular protein concentration

2.1.5 初始pH 值对胞外蛋白浓度的影响 随着pH 值升高，蛋白浓度逐渐升高，且当pH 值为8.0时蛋白浓度达到峰值（15.11±0.20）mg/mL。而pH 值达到9.0 时，蛋白浓度急速降低。结果显示，pH 在5～8，胞外蛋白浓度与pH升高呈正相关，pH大于8，蛋白产量降低（表7）。

表7 初始pH值对粗蛋白浓度的影响Tab.7 Effect of initial pH on extracellular protein concentration

2.2 方差分析

方差分析结果如表8所示。表8中F、Fα是方差分析F检验法中常用的符号，F＞Fα为显著性水平，Fα为根据数据自由度以及自由变量数的值，通过查阅不同显著水平下F分布检验表后所得的结果。通过与α=0.05 水平下的对比得出，培养温度对RT-BS07 株的胞外蛋白浓度有显著影响（P＜0.05）。结合单因素与正交试验结果（表9），培养温度最适值应为33 ℃。

表8 正交试验方差分析Tab.8 Analysis of variance

2.3 极差分析

由极差分析结果（表9）可知，5个因素的影响程度由大到小依次为D、A、B、E和C，即温度、盐度、转速、初始pH 值和培养时间。优化组合为A3B2C2D2E2，即盐度3.0%、转速150 r/min、培养时间36 h、培养温度33 ℃、初始pH值7.0，在此条件下进行试验，设置3个生物学重复。蛋白浓度测定为（22.91±0.91）mg/mL，高于正交试验预期值（20.61±0.21）mg/mL，表明该培养条件能够较好的促进枯草芽孢杆菌RT-BS07株的蛋白分泌。

表9 正交试验极差分析Tab.9 Range analysis

2.4 发酵蛋白抑菌实验分析

由图1可知，a即正交试验编号14，胞外蛋白浓度为（20.61±0.21）mg/mL，对维氏气单胞菌抑菌效果显著，抑菌面积达（11.45±0.97）mm2；对嗜水气单胞菌的抑菌面积最小仅（2.81±0.18）mm2。b 即正交试验编号2胞外蛋白浓度为（18.34±0.36）mg/mL，抑制嗜水气单胞菌的效果好，抑菌面积为（13.90±1.01）mm（2P＜0.05）；抑制鲁氏耶尔森氏菌面积最小为（6.63±0.63）mm2。发酵蛋白液c 即正交试验编号2，胞外蛋白浓度为（16.61±0.26）mg/mL 显著低于发酵蛋白液a，对维氏气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌的抑菌面积分别为（9.75±0.65）mm2、（4.06±0.60）mm2。d为正交优化培养条件所得，其胞外蛋白浓度为（22.91±0.91）mg/mL，对鲁氏耶尔森氏菌、维氏气单胞菌具有显著抑菌效果，抑菌面积分别为（13.87±1.03）mm2、（11.78±0.46）mm2，对杀鲑气单胞菌的抑菌面积为（6.02±0.44）mm2。结果表明，a 与c 对维氏气单胞菌抑菌效果显著，b 抑制嗜水气单胞菌效果显著，d抑制鲁氏耶尔森氏菌与维氏气单胞菌的效果显著。4 种蛋白粗提液对维氏气单胞菌均有良好的抑菌效果。

图1 胞外蛋白的抑菌分析Fig.1 Bacteriostatic analysis of extracellular protein

3 讨论与结论

试验中单因素控制变量比较结果表明，盐度1.0%，初始pH 值8.0，摇床转速150 r/min，培养温度28 ℃，培养时间48 h为最佳发酵条件。有研究表明转速过低培养基中的营养物质与菌株接触不充分，而转速过高对细菌造成机械性损伤影响蛋白分泌，都会对微生物发酵造成影响[26]。当培养时间达到72 h时，胞外蛋白浓度显著高于其他培养时间，但产生了强烈刺鼻性气味，推测是由于细菌发酵后期，分泌大量次级代谢产物或细菌死亡破碎溶解大量蛋白；而微生物的氨基酸代谢中发生脱羧反应产生有机氨，或者脱氨反应产生有机酸与氨气，使得菌液气味刺鼻[27]。

枯草芽孢杆菌的代谢产物包括抗菌蛋白、蛋白酶、脂肪酸等[28-29]，其种类与产量受培养基营养成分、发酵条件和高度复杂的代谢调节机制影响[30-31]。通过优化菌株的培养基组成或发酵条件可以充分发挥菌株代谢产物的潜力。路研等[32]利用单因素控制变量法与响应面分析法快速优化出枯草芽孢杆菌S-16株产胞外蛋白的发酵条件，初始pH 值为7.5的LB 液体培养基，菌种接种量为4.74%，在温度为34 ℃条件下振荡培养53 h，转速为200 r/min。秦楠等[33]采用单因素试验和响应面法对解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）HRH317 株产胞外蛋白的发酵条件进行优化。得到最佳发酵条件为初始pH 值7.0 的NB 培养液，菌种接种量4%，37 ℃下振荡培养24 h，转速为200 r/min。此次试验借助单因素试验与正交试验结合得到枯草芽孢杆菌RT-BS07株产胞外蛋白发酵条件，与以上研究相比初始pH值相近，培养温度、培养时间和转速则均有所降低，推测是由于菌株同属芽孢杆菌属但来源不同造成的。

菌株胞外蛋白对致病菌的抑菌效果常通过抑菌面积、抑菌直径、抑菌率等指标进行检测。王文君[34]优化枯草芽孢杆菌BL株发酵条件后，胞外蛋白抑制创伤弧菌（V.vulnificus）直径达21.21 mm，显著大于优化前的12.06 mm。吴惠仙[35]研究结果表明芽抱杆菌B0s1株胞外蛋白对嗜水气单胞菌CL99817株的抑菌率大于85%较优化前提高近20%。与前期多为单一受试菌株或相比，本试验观测了RT-BS07 株胞外蛋白对5 株水产常见条件致病菌的抑菌效果，结果显示对维氏气单胞菌具有较好的抑菌效果，但经过优化条培养获得的胞外蛋白抑制鲁氏耶尔森菌面积显著增大。结果还表明胞外蛋白浓度与同一菌株的抑菌面积不呈线性关系，可能是不同发酵条件下胞外蛋白中抗菌蛋白的类型或含量发生变化。由试验结果可见根据不同的抑菌需求，枯草芽孢杆菌RT-BS07株的培养条件应做适当调整。

本研究对枯草芽孢杆菌代谢产生胞外蛋白的培养条件进行优化分析，今后的工作中应关注抗菌蛋白的分离纯化，结构鉴定，抑菌机制及基因表达等方面[36]，以期为鲑鳟鱼类的病害防治及菌株的高效利用等方面提供数据参考。

综上，此次实验结合单因素控制变量法与正交试验得出枯草芽孢杆菌RT-BS07 株产胞外蛋白的最佳发酵条件为盐度3.0%、初始pH 值7.0、转速150 r/min、培养时间36 h、培养温度33 ℃，可获得（22.91±0.91）mg/mL 的胞外蛋白产物，显著高于常规培养的蛋白浓度（12.74±0.26）mg/mL。其胞外蛋白对鲁氏耶尔森菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等常见条件致病菌的抑菌效果显著，这些研究结果为该菌株在今后的水产养殖中的抗菌及生物绿色防治等方面的应用提供理论参考。

致谢：黑龙江水产研究所李绍戊研究员对本研究给予了帮助，冷水性鱼类病害防控创新团队项目（2020TD43）同时对本研究给予了资助，谨致谢意!