TSP-1等血管相关因子在不同亚型PCOS患者血清中的表达

梁莎 王施元 刘羽 王超 张玉红 白洁明 王宇欣 公丕东 刘梅梅

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期妇女常见的一种内分泌异常所致的疾病，以稀发排卵或无排卵、高雄激素血症、超声提示卵巢多囊改变、生育力下降等为临床主要特点，在19～25岁女性中发病率可达5%～7%[1]。其发病机制至今未明。有研究表明：育龄期PCOS患者卵巢超声影像主要是以卵巢体积、卵巢间质面积比增大,小卵泡数目增多,间质回声增强,卵巢间质血流丰富为表现特征[2]。超声显示PCOS患者的卵巢间质血流丰富、波峰较为圆顿，呈高速低阻力型，并且随月经时间而变化[3]。血管生成失调可能是PCOS发生发展的主要原因之一[4]。

凝血酶敏感蛋白1(thrombin sensitive protein-1，TSP-1)又称为血小板反应蛋白-1，是一种重要的抑制血管生成因子，可通过与多种受体结合，抑制血管内皮细胞的迁移、诱导内皮细胞凋亡。TSP-1 主要部分序列可通过CD36 信号途径诱导凋亡，CD36 是 TSP-1 抑制内皮细胞迁移和抗血管新生的一关键受体[5]。内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是血管内皮损伤性疾病的共同致病因子，为目前公认的反映血管内皮细胞损伤的特异性首选指标；其能刺激内皮细胞产生大量的超氧离子，导致血管内皮功能的损伤，引起血管内皮功能紊乱；也是一种重要的血管生成因子参与血管生成[6]。

本研究拟通过检测PCOS患者血清中TSP-1、ET-1、CD36的表达状况，探讨各血管因子与PCOS不同分型间的关系，揭示PCOS卵巢间质血流的变化原因，为进一步了解PCOS的发生发展提供一定的实验基础。

对象与方法

1.研究对象:选取2016年3月—2017年5月在哈尔滨医科大学附属第二医院生殖中心就诊的PCOS的患者223例作为实验组；选取同时期就诊因男性因素不孕的育龄期正常女性62例作为正常对照组。所有入组患者均排除全身炎症性疾病、甲状腺疾病、高泌乳素血症、肾上腺疾病、高血压、糖尿病等合并症及并发症，近6个月内无任何激素类药物服用史。

2.分组:按鹿特丹国际会议制定的诊断标准与中国(2011年)PCOS诊断标准：①稀发排卵或无排卵的临床表现包括：a.月经稀发：月经周期长度为35天～6个月；b.闭经：继发闭经(停经时间≥6月)或原发闭经(16岁尚无月经初潮)；c.不规则子宫出血：月经周期或经期或经量无规律性。②临床或生化上有高雄激素表现的临床表现为：a.高雄激素症状：痤疮、多毛(以Ferriman-Gallwey体毛评价标准[7]，F-G评分≥6分诊断多毛)、超重(BMI≥24 kg/m2)、黑棘皮症等；b.血清生殖激素浓度测定：高雄激素血症(总睾酮值>0.48 ng/ml)。③超声检查显示卵巢多囊性改变(PCO):一侧或双侧卵巢内直径2～9 mm的卵泡数≥12个，和(或)卵巢体积≥ 10cm3[卵巢体积按0.5X长径(cm)X横径(cm)X前后径(cm)计算]。并排除可能引起高雄激素的疾病和引起排卵异常的疾病如：甲状腺功能异常、高泌乳素血症、迟发型肾上腺皮质增生、21羟化酶缺乏症、柯兴氏综合征、原发性卵巢功能减退或卵巢早衰、卵巢或肾上腺分泌雄激素肿瘤、功能性下丘脑性闭经等。符合①②③条者为HOP组；符合①③条者且不符合②条者为OP组；符合①②条者且不符合③条者为HO组；符合②③条者且不符合①条者为HP组。

正常对照组纳入标准：① 因男方不育因素就诊的患者；②月经规律，无PCOS临床表现；③内分泌水平无异常，包括性激素水平、口服葡萄糖耐量试验、胰岛素抵抗；④超声下子宫及双侧卵巢无异常改变。

3.实验方法

(1)血清样本的收集。所有入组者均于卵泡早期(月经周期第2～4 日)或闭经2个月以上(排除妊娠)，经阴道超声检查双侧卵巢内无优势卵泡时，于晨起空腹抽取外周静脉血5 mL，置于离心管中，后置于离心机中以2 000 r/min给予离心后，取其血清冻存于-20℃冰箱中备用。

(2)血清中TSP-1、CD36、ET-1水平的测定。采用酶联免疫吸附法，按试剂盒说明书要求依次分别检测所有患者血清中TSP-1、CD36、ET-1水平。

结果

本实验共纳入患者285例：正常对照组62例；PCOS患者223例，其中HOP组48例，OP组58例，HO组63例，HP组54例。

1.PCOS组和正常组一般资料比较：PCOS组体重、BMI均高于正常对照组(P<0.05)，年龄、身高以及F-G评分两组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组患者一般临床资料比较

2.各亚型间血管因子TSP-1、CD36、ET-1的比较：PCOS组血清中ET-1的表达水平高于正常对照组(P<0.05)。PCOS亚型间比较，血清ET-1水平HOP组高于其他组(P<0.05)。PCOS组血清中TSP-1、CD36的表达水平低于正常对照组(P<0.05)。PCOS亚型间比较血清TSP-1、CD36水平HOP组低于其他组(P<0.05)，见表2。

表2 各组患者的血管因子的比较

3. PCOS患者TSP-1、ET-1、CD36相关性分析：通过分析血清学指标可以发现TSP-1、CD36的表达PCOS组低于正常对照组(P<0.05)；ET-1的表达PCOS组高于正常对照组(P<0.05)。各因子在PCOS组各亚型间的表达：①CD36：HOP组患者明显低于其他各型，且有统计学意义(P值分别为0.005，0.009，0.002)，OPHO组，HP>HO组，且都有统计学意义(P值分别为0.035，0.037)。各因子之间的相关性分析为TSP-1与CD36之间呈显著正相关，且有统计学意义(P<0.001)，见图1；ET-1与CD36,TSP-1与ET-1之间不相关，见图2、图3。

图1 TSP-1与CD36的相关性分析

图2 ET-1与CD36的相关性分析

图3 TSP-1与ET-1的相关性分析

讨论

1.PCOS不同亚型：各国根据国情陆续出现各种关于PCOS的诊断标准，然而由于病因不清，临床表现具有显著的个体差异，各种诊断标准都缺乏循证医学的有力证据。2003年出台的鹿特丹诊断标准至今被广泛应用，本研究主要参考鹿特丹诊断标准，将纳入研究的多囊卵巢综合征患者分为4个临床亚型。不同亚型的PCOS患者的实验室指标和代谢水平也不相同。有研究发现HOP组的胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均高于其他各组，且与正常组相比有统计学意义，说明HOP组引起的脂代谢紊乱是最严重的；而HP组患者则更容易引起糖代谢紊乱[8]。对于PCOS不孕症的患者来说，不同亚型患者因其体内的激素水平不同，其妊娠结局以及妊娠早期胚胎丢失和自然流产率也是不同的，所以治疗方案也有所不同。因此，分析不同亚型的多囊卵巢综合征的临床和实验室指标的特征，对临床个体化治疗具有有效的指导意义，从而达到最理想的治疗效果。

2.PCOS与血管相关研究：实验发现卵巢组织的血流灌注呈周期性变化[9]。异常的卵巢血管生成将导致相关的卵巢病变，如彩色多普勒超声显示：PCOS患者的卵巢以卵巢间质及卵泡的血管增生、血流丰富而引起的卵巢增大的为主要特征[10]，卵巢间质及卵泡周围的膜部血管增生，血流丰富，波峰圆顿，呈高速低阻力型。血管增生是新生血管生成的同时血管内皮细胞凋亡减少，调控血管生成的因子与调控抑制血管生成的因子功能失常，最终导致血管生成比例失调。

(1)TSP-1/CD36与PCOS相关性。本课题组之前初步的研究发现，PCOS患者的血清中TSP-1的表达下降，提示TSP-1可能与PC0S存在相关性，考虑可能与血管生成或炎性反应有关[11]。TSP-1的CSVTCG序列和GVQXR序列可与CD36结合，激活p38应激激酶和半胱天冬酶，从而抑制内皮细胞增殖[12]。抑制TSP-1的受体CD36能够减少卵泡凋亡，促进颗粒细胞的增殖。PCOS组患者的卵巢组织中CD36的表达明显降低，且可能和其远期并发症如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等具有共同的易感基因。本实验研究结果显示PCOS患者血清中TSP-1和CD36呈显著正相关，且HOP组患者血清学TSP-1的值明显低于其他各组，与HO与OP组相比具有统计学意义，而临床上PCOS患者中又以HOP组患者症状最为典型，引起的脂代谢紊乱最为严重，为进一步实现个体化治疗提供了思路；HO组患者无卵巢多囊样改变，但本实验测得其血清TSP-1水平与正常组相比有统计学意义，而CD36水平与正常组相比则无太大差异，尽管不能排除实验过程中因样本量较少或其他因素引起的误差，但也有可能提示了这部分患者存在一些微小血管的增生。血管的异常生成与调节血管生成的各细胞因子密不可分。

(2)ET-1与PCOS相关性。近年来很多的实验都证明了，ET-1参与新生血管的各个阶段，如内皮细胞增殖、侵袭基底膜、释放蛋白酶、微血管形成等。ET-1作为血管生长因子通过促使细胞增殖、迁移、抑制其凋亡并促进血管生成因子VEGF的分泌[13]最终起到促进血管生成作用。其通过与卵巢组织内的相应受体相结合通过调节血管的舒缩活动，来实现对卵巢血流的调控。Wenner等研究发现ET-1具有ET-A和ET-B两种特异受体，前者起收缩作用，后者起舒张作用，主要分布于血管内皮细胞[14]。故推测PCOS患者的卵巢间质血流的增加可能与ET-1的舒血管作用增强和新生血管增加有关，具体机制有待进一步研究证实。但Foltyn等认为PCOS患者ET-1血清表达水平与正常女性并无区别[15]。这与本实验发现了PCOS各亚型患者的血清ET-1水平都高于正常对照组，且都有统计学意义的观点相悖。

3.实验的意义与局限性:通过实验可知，PCOS患者的卵巢血管生成增加与促血管生成因子和抑制血管生成因子之间关系密切，三者之间相互作用，互为因果。通过对PCOS患者的分型，可以使后续的临床治疗更有个体化。但是本实验仍存在一些不足，其一，用患者外周血清中的因子水平来代表卵巢血管的变化，仍不足以让人信服，通过大量文献，可以认为卵泡液中血管因子的变化要优于外周血。其二，PCOS患者的显著特征为激素水平的紊乱，若本实验能结合患者的激素水平和糖脂代谢等指标综合分析，将更具有说服力。