不同产地青钱柳HPLC指纹图谱的建立

张晓芹，陈礼平，王慧玉，袁宙新

(浙江省丽水市中医院·浙江 丽水 323000)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)是胡桃科青钱柳属乔木，为国家二级保护树种，被誉为“植物界的大熊猫”、“医学界的第三棵树”。《中国中药资源志要》记载，青钱柳叶具清热、消渴、解毒之效，近年研究其具有降血糖、降血压、降血脂的作用[1-3],通常作为一种茶剂，泡茶饮用，近年逐渐被应用于临床领域。

目前从青钱柳中已分离并得到的化学成分主要有黄酮类、多糖类、三萜类、酚酸类和无机元素类等[4]，青钱柳叶多糖成分具有明显的降血糖作用，并可增强糖尿病小鼠对葡萄糖的耐受力，保护胰岛细胞，青钱柳叶水提物和总黄酮能降低自发性高血压大鼠的收缩压和舒张压，并且青钱柳具有较好的抗氧化作用[5-7]。

目前已经采用UPLC-MS/MS法对青钱柳中芦丁、金丝桃苷等6种黄酮类成分进行含量测定的报道[8]，也有青钱柳老叶和嫩叶中绿原酸、山柰酚等5种化学成分含量测定的报道[9]，但对于青钱柳的质量评价方法尚需要进一步研究。

本文基于HPLC对青钱柳的质量评价方法开展研究，建立能够体现青钱柳整体特征的HPLC指纹图谱，研究不同产地青钱柳的质量差异，为青钱柳的质量控制提供参考。

1 实验材料

1.1 试药 金丝桃苷对照品：中国食品药品检定研究院，含量：94.9%，批号：111521-201809；异槲皮苷对照品：中国食品药品检定研究院，含量：97.2%，批号：111809-201804；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品：成都普思生物科技股份有限公司，纯度：98.0%，PS011018；山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品：成都普思生物科技股份有限公司，纯度：100%，PS011722；阿福豆苷对照品：成都德思特生物技术有限公司，纯度：98.60%，DST190102-029。乙腈为色谱纯，其他均为分析纯。青钱柳样品见表1(本研究选择批号为S1的批次开展各项方法研究)。

表1 青钱柳样品信息

1.2 仪器 MSA 225S-1CE-Du电子天平：德国赛多利斯公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；1260 Infinity液相色谱仪：Agilent Technologies。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取青钱柳叶片，粉碎后过60目筛，取青钱柳粉末0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W、频率60 kHz)45 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 对照品溶液的制备 分别取金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品、阿福豆苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含45、30、170、40、45μg的混合溶液，即得。

2.3 色谱条件 Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱：0～5 min，9%A；5～20 min，9%～15%A；20～25 min，15%～21%A；25～55 min，21%～25%A；55～60 min，25%～55%A；60～62 min，55%～95%A；62～65 min，95%A；流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量10μL，检测波长254 nm。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品(S1)6份，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，以5号峰山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为参照峰(S)，计算指纹图谱各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，测得8个共有峰的相对保留时间RSD分别为0.14%、0.08%、0.04、0.03%、0.00%、0.03%、0.04、0.04%，相对峰面积的RSD分别为0.90%、0.36%、0.15%、0.56%、0.00%、0.15%、0.81%、0.16%；表明仪器的精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一供试品(S1)6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，测定，记录色谱图。以5号峰山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为参照峰，测得8个共有峰的相对保留时间RSD分别为0.07%、1.97%、1.16%、0.01%、0.00%、0.04%、0.04%、0.04%，相对峰面积的RSD分别为1.84%、1.91%、2.60%、2.77%、0.00%、0.74、2.37%、2.35%；结果表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品(S1)6份，按“2.3”项下色谱条件，分别在0、5、10、15、20、30、40 h进样，记录色谱图。以5号峰山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为参照峰，测得8个共有峰的相对保留时间RSD分别为0.25%、0.15%、0.31%、0.03%、0.00%、0.04%、0.05、0.05%，相对峰面积的RSD分别为0.88、0.48%、0.15%、0.51%、0.00%、0.16%、1.88%、0.15%；表明供试品溶液在40 h 内稳定。

2.5 指纹图谱的建立 将26批青钱柳样品按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定。将所得的26批青钱柳的HPLC图谱以AIA格式依次导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件，采用中位数法生成青钱柳的HPLC指纹图谱以及对照图谱，分别见图1、图2。图谱中共检测到8个共有峰，通过与混合对照品比对可以指认其中5个成分，见图1、图2。26批三叶青样品中各共有峰的相对保留时间以及相对峰面积见表2、表3，相对保留时间的RSD值均小于3%，共有峰相对峰面积的RSD值较大，最大可相差到107.47%，最小为41.57%。

表2 26批青钱柳样品的相对保留时间

表3 26批青钱柳样品的相对峰面积

图1 26批青钱柳样品的HPLC叠加图谱(S1～S26)

1、2、7.为未知峰；3.金丝桃苷；4.异槲皮苷；5. 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；6.山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；8.阿福豆苷

2.6 指纹图谱的相似度评价 相似度评价结果见表4。26批样品与对照图谱的相似度在0.798～0.992，其中S1的相似度为0.798，S8的相似度为0.898，其余样品的相似度均>0.900。

表4 26批样品相似度评价结果

2.7 聚类分析 以各样品8个共有峰的峰面积为变量，利用SPSS 21.0聚类分析，对26批样品进行分类。聚类结果见图3。当判别距离为10时，26批样品分为3类，总体而言，江西九江市、浙江遂昌县、浙江武义县产样品聚为1类，浙江青田县产样品聚为1类，浙江景宁县产样品聚为1类，浙江莲都区产地的样品较为离散。通过聚类分析，基本可以看出，不同产地青钱柳样品具有一定的质量差异。

图3 26批青钱柳样品聚类分析

3 讨论

3.1 提取方法及流动相的考察 本文分别考察了不同提取溶剂(水、30%甲醇、80%甲醇、甲醇)，不同提取方式[超声(功率250 W、频率40 kHz)、加热回流]，提取溶剂的不同用量(15 mL、25 mL、35 mL、50 mL)以及不同提取时间(15 min、30 min、45 min、60 min)等提取方法，最终确定供试品最佳制备方式为：加入80%甲醇 50 mL，超声提取45 min。再对甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.2% 磷酸等流动相系统进行筛选，确定乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱效果最佳。采用三维采集模式进行不同波长下各样品峰的吸收度考察，发现254 nm下，基线相对稳定，色谱峰分离度及响应度较佳。

3.2 指纹图谱及聚类分析 指纹图谱及聚类分析发现，不同产地青钱柳样品具有一定的质量差异性。在相似度评价中，样品S1(江西九江市)的相似度仅有0.798，样品S8(浙江缙云县)的相似度为0.898，其余样品与对照图谱的相似度均大于0.9。分析发现，这两个样品均为野生品，采集时植株本身较小，因此，生长年限有可能是造成其相似度较低的原因。在聚类分析中，当判别距离为10时，26批样品可分为3类，基本上同一产区样品可聚为1类，然而S1 (江西九江市)、S8(浙江缙云县)、S17(浙江省青田县)、S20(浙江省遂昌县)3 个样品离散分布，未与同一产地样品聚为一类，生长年限可能是影响因素之一。从相对峰面积的RSD结果可以看出，不同批次样品其相对峰面积具有较大差异，说明不同批次样品的含量具有一定差异。本文所选取的样品中，浙江省遂昌县为种植品，据调研，这些种植品是以山上野生品为基础，直接移栽至基地，基地也是仿野生种植，其在移栽及后续种植过程中，是否发生质量差异，尚需要进一步研究。

本文对26批青钱柳叶片样品进行了HPLC指纹图谱构建和解析，标定了8个共有峰，所建立的青钱柳指纹图谱，方法操作简便、重现性好，可表征青钱柳不同产区的质量差异，为青钱柳产地选择、质量评价和临床应用提供参考。