乳制品检验液相色谱分析方法的建立与优化

陈柏锡，孙嘉昊，刘 威，张文琪，吴晓辉

青岛新希望琴牌乳业有限公司，山东青岛 266000

0 引言

随着我国经济水平的快速增长和国民购买力的普遍提高，以乳制品为首的健康食品产业正在蓬勃发展，乳制品的产量、销量、市场需求量和进口量均大幅上涨，与乳制品市场规模发展相伴而来的是对乳制品检验工作更加严格的要求，尤其是对乳制品中农药、兽药残留；食品添加剂以及违禁品的检测更为严格。高效液相色谱法具有检出限低，精度高，重复性好的特点，而且可实现操作的自动化，能够在较短时间内进行数量众多样品的日常分析，所以在检验领域占有十分重要的地位[1]。而在液相色谱法中，反相色谱因其可调节参数多，试剂成本较低，污染较小，普适性较强等特性，被广泛应用于食品检测中。本文以反相色谱法为研究对象，详细介绍了反相色谱方法的开发与优化步骤，对可优化的参数逐一列举，对于食品检测方法的开发具有一定的参考价值。

1 反相色谱方法的建立

要对某种或多种目标物质建立合适的分析方法，首先要收集目标物质的相关信息以及确认实验室的仪器条件，从而筛选可行的分析方法。选取合适的色谱条件是必不可少的，如：流动相的种类、色谱柱型号、进样量、柱温、检测器种类等，通过连续的实验确定色谱条件后，还要根据具体的出峰情况对方法进行优化以得到更好的检测效果。根据流动相和固定相极性的不同，液相色谱可分为正相色谱和反相色谱，反相色谱用超纯水做基础溶剂，用极性弱于水的有机溶剂如甲醇、乙腈等做有机相[2]，由于反相色谱可以调节的参数更多，普适性也更强，所以本文以反相色谱法的建立与优化为例，以供参考。

1.1 收集目标物信息

首先要确定待测目标的个数、种类、相对分子质量、分子结构和官能团种类、溶解度以及酸度系数（pKa）和浓度范围。上述信息的收集对于方法选择和建立是至关重要的。如果目标物数量过多则需要在方法建立之初考虑目标峰分离的问题，而待测物质的相对分子质量通常会影响色谱条件的选择，一般分子量较大的目标物质，如蛋白质分子、核酸或一些聚合物通常需要使用大孔径的色谱柱，分子量较小的化合物可以使用后文介绍的通用初始色谱条件。分子结构及官能团决定了检测器的种类和波长的选择，比如亚砜（S=O键）在210 nm具有较好的吸光度，而碘化物在280 nm处吸光度最大，如果能得到目标样品的光谱图，则能够快速的得知检测器的最佳波长。对于目标物质的溶解度需要进行简单的分类，一般能溶于水相或甲醇、乙腈类有机溶剂的样品，通常使用反相色谱法进行检测，若样品只能溶于正己烷等低极性的有机溶剂，则要考虑正相色谱或其他的分析方法。若目标样品是弱酸、弱碱类的非中性化合物，需考虑在流动相中添加相应的缓冲盐溶液调整其pH值。综上所述，对于目标物质的研究越充分，信息收集的越完善，越利于后期方法的建立和优化。

1.2 初始方法的建立

当确定该目标物质能够使用反相色谱的方法进行分离时，需要一个初始色谱条件作为摸索和优化检测方法的开端。初始条件中流动相一般使用较高的有机溶剂比例，对样品出峰的先后顺序以及特点进行分析，再进行具体的色谱条件调节。经过实验，以下色谱条件作为初始色谱条件，普适性较好：选择C18色谱柱（ODS柱），进样体积20 μL，流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测器波长根据目标物质官能团的不同进行具体的选择，流动相选择80%的甲醇或乙腈，运行时间调整为40～60 min，在初始条件下观察出峰结果。由于初始色谱条件的流动相有机溶剂比例较高，所以出峰时间相对较快，多个目标峰聚集较为密集，若在初始条件下仍有目标物质未出峰，则要考虑溶剂强度更高的有机溶剂，如四氢呋喃、乙腈等。

1.3 流动相的选择和调整

反相色谱的流动相通常由有机相与水溶液（缓冲液）组成，可以通过调节有机相的种类、比例以及调节流动相的pH值达到提高分离度、改善峰型、改善目标物保留值等目的，这是其他色谱方法所不具备的优势。当用初始色谱条件能够检测到目标物质出峰后，根据目标物质的出峰时间降低有机相的比例，直到目标物质出峰时间在一个合适的区间。改变有机溶剂的种类同样可以改变目标物质的出峰时间，通常情况下有机溶剂的溶剂强度越大，洗脱能力越强，目标物质出峰速度越快。相同比例的有机相-水溶液的洗脱能力：四氢呋喃＞乙腈＞甲醇。某些弱酸或弱碱性物质在水溶液中会发生电离，导致目标物质在色谱柱上保留值很低甚至完全不保留，此时可以使用不同种类的缓冲盐溶液来调节流动相的pH值，减少目标物质的电离。

通常在对上文给出的初始条件下分离得到的结果进行流动相参数调整时，宜按照以下步骤操作：先改变有机相的比例，如：将80%的甲醇水调整为65%甲醇水，当只改变有机相比例不足以满足实验要求时，应改变有机相的种类，如将甲醇替换成乙腈或四氢呋喃，或者将几种有机溶剂按照一定比例进行混合。当调整了有机溶剂比例和种类后，目标物质仍然出现较低的保留值，则应考虑使用不同pH值的缓冲溶液，提高目标物质的保留值。磷酸缓冲液最常用的缓冲溶液，通过配制0.2 M磷酸二氢钠溶液和0.2 M磷酸氢二钠溶液，按照一定比例进行混合，可以配制出不同pH值的磷酸缓冲液。

2 反相色谱方法的优化

在建立一个检测方法之初，新的方法不可能是完善的，通常会出现如：分离度不满足要求，回收率较低，出峰时间过早或过晚，噪声信号过高影响方法检出限等问题，所以对新建立的方法进行优化和调整是必要的。

2.1 改善分离度

分离度是评价多个组分之间分离效果的重要指标，其数值等于两峰顶点的间距与两峰峰底宽之和比值的两倍，即：两峰的顶点间隔越远，两个峰宽度越窄、越尖锐，分离度越好。一般在优化分离度时通常使用如下公式：

其中Rs为两目标物之间的分离度，N为理论塔板数，α为两峰保留值的比值，k为两峰保留值之和的平均值。根据上述公式，要提高两种目标物的分离度可以通过提高理论塔板数N来实现，比如使用更长的色谱柱通常会改善分离效果。通过调整流速也可以提高柱效，一般情况下低流速拥有更高的柱效，但流速不宜过低，一般在0.8～1.5 mL/min为佳。通过提高目标峰的保留值，也可以提高目标物之间的分离度，比如降低流动相中有机溶剂的比例、将有机溶剂更换为溶剂强度较弱的，如把乙腈换为甲醇等，但提高保留值或者使用较长色谱柱的同时，通常会使得出峰时间后延，所以要根据实验的具体需要加以权衡。

2.2 优化出峰时间

经过前处理后的样品中会含有少量的保留值较低的杂质，当目标物质的出峰时间过早时，有可能与杂质峰相互重叠，为了权衡出峰效果和工作效率，一般将出峰时间调整在10～30 min[3]。通过调整流速、有机相的比例等可以达到调整出峰时间的效果，通常有机溶剂的比例越高，出峰速度越快。在方法建立之初，可以根据实际的出峰效果，选择更长或更短的色谱柱达到增加和缩短出峰时间。实验中偶尔会发生出峰时间波动的现象，其原因有可能是色谱柱温度范围控制不当导致温度波动太大所导致的，也可能是由于流动相未充分混匀导致组分发生变化产生的[4]，尤其是流动相添加了多种组分，如：离子对试剂、峰拖尾改善剂等，应注意摇匀后抽滤使用。

2.3 提高信噪比

信噪比（S/N）是目标物质信号与噪声信号的比值，在液相色谱的图谱中通常使用目标峰扣基线后的高度与基线宽度做比值。提高信噪比对于提高检测精度和确定检出限、定量限均具有重要意义[5]。提高信噪比要从提高目标信号或降低噪声信号入手。提高目标信号可以通过：增加样品浓度、增加进样体积、选择合适的检测器波长等方法实现，但样品浓度或进样体积过大也会造成峰展宽、拖尾等现象，需通过实验进行调节。噪声信号主要是基线不平稳抖动产生的，通常流动相或其他溶剂中的气泡会导致基线的抖动，增加噪声信号，流动相配制后经过0.22 μm滤膜进行抽滤，配制流动相的试剂选择色谱纯或优级纯，配制完成后进行超声排气，在检测时将冲洗阀拧松，用大流量进行排气5～10 min，并使用仪器自带的在线脱气系统进一步将溶剂中的气泡排出，可以保证基线平稳[6]。当色谱柱被污染时，也会造成噪声信号的提高，所以在检测时安装保护柱是必要的，当色谱柱被样品污染时，可以使用高溶剂强度的试剂，如纯甲醇或乙腈对色谱柱进行冲洗，在实验结束后对色谱柱进行冲洗和纯甲醇充满色谱柱的操作也能够避免样品的污染。另外，柱温箱温度的波动和系统压力的波动也会增加噪声信号。

2.4 优化系统压力

当液相色谱系统中的流速固定时，理论上系统的压力也是一定的，当系统的压力不稳定或出现压力偏高或偏低时应考虑系统内部的异常[7]。正常液相色谱系统的压力应在150 bar以下。流速过快会导致系统压力的上升，通常流速在1.0～1.5 mL/min为最佳，不宜超过2.0 mL/min[8]。流动相的黏度也会影响系统的压力，当系统压力偏高时应考虑更换黏度更低的流动相，如将甲醇替换为乙腈等。当同一个检测方法在参数未发生改变，但两次检测压力差距过大时应考虑仪器内部设备是否出现堵塞的现象，如色谱柱堵塞、过滤白头堵塞等。色谱柱所处的温度对系统压力也有一定的影响，通常柱温越高，压力越低[9]。

2.5 改善峰拖尾

峰拖尾是最常见的峰型异常情况，一般的峰拖尾会影响检测结果的精度、柱间重复性等，而严重的峰拖尾会拖延至下一目标峰中，影响二者的分离度[10]。峰拖尾常出现在使用过度的色谱柱中，当色谱柱被强保留样品污染时造成的峰拖尾可以使用强溶剂进行冲洗，冲洗顺序为：纯甲醇——异丙醇——二氯甲烷——异丙醇——纯甲醇。必要时也可以用强溶剂低流速对色谱柱进行反冲。

峰拖尾也有可能是柱外效应导致的，尤其是当色谱系统的死体积较大时易出现拖尾。柱外效应导致的拖尾现象通常是先出的峰拖尾严重，越靠后的峰拖尾越轻的规律，可以采取减少仪器组件之间管路连接长度，使用体积较少的流通池以降低死体积，并注意样品浓度和进样体积，避免过载。目前越来越多的研究者用减小流动相 pH 值或者添加三乙胺等物质抑制硅羟基的解离，从而降低峰拖尾的现象[11]。

3 总结

无论是根据已有的液相色谱分析方法进行优化，还是重新建立一个分析方法，都应该以最终的实验结果为导向，并从前处理、色谱条件、分析过程与最终结果等多个方面综合考量，在具体的实验数据和图谱当中找到可以优化的点，并将其与具体的色谱条件结合起来，修正条件后重复实验直到过程和结果均趋于稳定。当改变某个色谱条件时通常会引起多个参数的改变，应在设计方法时加以权衡，找到最适合当前色谱条件的分析方法。C