宁夏规模牧场犊牛病毒性腹泻流行病学调查

张立强，雷 静

宁夏农垦贺兰山奶业有限公司，宁夏银川 750011

0 引言

牛病毒性腹泻病（Bovine Viral Diarrhea，BVD）是由牛感染牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引起以发热、腹泻、消化道黏膜糜烂、产奶量下降、流产和死胎等为特征的一类急性、接触性传染病[1]。BVDV感染奶牛后会造成奶牛发生持续性感染、免疫抑制，会出现长期带毒乃至终生带毒的状态，对奶牛养殖业产生了巨大影响，造成了巨大的经济损失[2]。1946年，Olafson等[3]首先发现BVDV在美国纽约州存在；1980年，该病毒在我国首次被发现[4]。目前该病毒已经在我国各个省市和地区广泛流行，成为我国奶牛养殖业的潜在危险，影响奶牛业的健康发展。

BVDV是一种具有囊膜的正链RNA病毒，属黄病毒科、瘟病毒属成员[5]。基因组长12～13 kb，由三部分组成，分别是5'端非编码区、开放阅读框（ORF）编码区和3'端非编码区[6]。BVDV的主要来源是带毒动物及被感染的患病动物。冬末和春季是本病的高发季节。BVDV遍布于世界各国，呈地方流行性，在封闭集约化的牧场发病常呈爆发式流行[7]。由于BVDV感染牛对奶牛养殖业造成的损害十分严重，因此世界动物卫生组织（OIE）将该病列为B类疫病，也是在我国进境动物必需进行检疫的疾病之一[8]。为了揭示宁夏银川地区某规模牧场犊牛BVDV的感染情况，采集该牧场犊牛血液共计69份，粪便拭子69 份，通过血清流行病学和分子流行病学调查的方法检测BVDV，为该地区防控BVDV提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021年9月至2021年12月采集银川地区某规模牧场犊牛血液69 份，放置于采血器中析出血清，分装至1.5 mL离心管中并进行编号，-20 ℃冰箱中保存备用；集粪便拭子样品69 份，-80 ℃低温冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂

BVDV ELISA抗原检测试剂盒，IDEXX公司；PrimeScript™ RT Master Mix，病毒RNA提取试剂盒，2×PCR MIX，宝日医生物技术（北京）有限公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 样品处理

将采集血液的采血器放于室温静置等待血清析出，将析出血清移至干净的1.5 mL离心管中，编号，放置于-20 ℃冰箱保存。

在-80 ℃低温冰箱中将粪便拭子样品取出，放置于4 ℃冰箱中融化，加入2 mL超纯水，充分振荡摇匀，混匀，取1.2 mL混匀液体于1.5 mL离心管，4 ℃ 10 000 r/min离心15 min，离心后取上清液，用0.22 μm微孔滤膜，得到样品，放置于-80 ℃低温冰箱中保存，备用。

1.4 血清学抗原检测

ELISA检测：取出犊牛血清，恢复至室温后，按照IDEXX BVDV抗原检测试剂盒说明书进行检测。

结果判定如下：检测计算样品的校正OD值。被检样品的S-N值≤0.300，可判为BVDV抗原阴性；被检样品的S-N值＞0.300，则可判为BVDV抗原阳性。

1.5 BVDV RT-PCR 检测

1．5．1 RNA提取

从-80 ℃低温冰箱中将处理的粪便样品，放置在4 ℃冰箱中进行融化，使用病毒RNA提取试剂盒按照说明书提取RNA，按照PrimeScript™ RT Master Mix将提取样品的总RNA反转录成cDNA。

1．5．2 引物设计

根据王标[6]采用的方法，设计通用检测引物（表1）。

表1 BVDV 5'-UTR 基因的引物序列

1．5．3 RT-PCR检测

按照表2反应体系及扩增条件进行RT-PCR，结束后进行琼脂糖凝胶试验，分析条带大小，判定结果。

表2 RT-PCR 反应体系及扩增条件

1.6 微流控芯片检测BVDV

1．6．1 样品准备

按照爱基因公司犊牛腹泻相关病原四联快速检测试剂盒说明书，对样品进行前处理后，提取血清中的RNA，-80 ℃保存待检。

1．6．2 试剂准备

将试剂盒各试剂充分混匀，分装入1.5 mL离心管后加入荧光等温扩增预混液20 μL，备用。

1．6．3 反应条件

温度：63.5℃，时间：30 min，程序：低速离心1 600r/min 10 s：高速离心转速4 600 r/min 30 s

1．6．4 判定标准

阳性：反应结束后，项目检测孔位出现明显扩增曲线，且Ct值＜30，判定该孔样品为阳性。

阴性：反应结束后，项目检测孔位未出现明显扩增曲线，判定该孔样品为阴性。

2 结果与分析

2.1 ELISA 和RT-PCR 检测结果

本次试验对宁夏银川地区某规模牧场69 份疑似BVDV感染的犊牛血液进行了BVDV抗原ELISA检测；对69 份疑似BVDV感染的犊牛粪便样品进行了RT-PCR检测，结果阳性率均为为7.24%（5/69），结果见表3，RT-PCR检测结果见图1。

表3 BVDV 感染的ELISA 和RT-PCR 检测结果

图1 病原核酸检测结果

2.2 微流控芯片检测结果

爱基因微流控芯片犊牛腹泻相关病原检测试剂盒结果阳性对照见图2；阴性对照见图3；5 份阳性样品检测结果见图4，5 份样品均出现明显的扩增曲线，确定为BVDV阳性。

图2 微流控芯片犊牛腹泻相关病原检测阳性对照

图3 微流控芯片犊牛腹泻相关病原检测阴性对照

图4 微流控芯片犊牛腹泻相关病原样品检测结果

3 讨论

本试验对银川地区某规模牧场犊牛BVDV的感染状况应用ELISA与RT-PCR方法进行检测，BVDV阳性牛检出率为7.24%。因BVDV对奶牛场危害非常严重，并且此病无特效药，现在规模化奶牛场均制定免疫程序对全牛群进行免疫接种，防控措施主要以免疫-检疫-淘汰为主[10]。