1例染色体结构变异无精症患者的纳米孔测序临床应用*

王亚，黄明涛，刘安，周冉，张沁欣，胡平，许争峰

(南京医科大学附属妇产医院生殖医学国家重点试验室，南京市妇幼保健院产前诊断中心，南京 210001)

结构变异(structure variants，SVs)是一种大于等于50 bp的基因组重排的统称[1]，包括：缺失(deletion, DEL)、重复(duplication, DUP)、插入(insertion, INS)、倒位(inversion, INV)、易位(translocation, TRA)等[2]。由于二代测序技术受到读长较短、PCR扩增偏好性等影响，使得目前学界对复杂染色体结构变异的研究较少，导致结构变异与疾病之间的相关性不明确[3]。伴随着第三代测序技术的发展，牛津纳米孔测序技术(oxford nanopore technology, ONT)和PacBio单分子测序技术(single molecule real time, SMRT)的出现[4]，使得人们认识到结构变异与神经发育障碍[5-6]、复发性流产[7]以及男性不育[8]等疾病密切相关，其中约10.3%的低生育能力男性中染色体存在异常[9]。但因二者检测和分析难度较高，尚不能完全进入临床应用阶段。因此，建立完善的纳米孔测序试验和生物信息分析流程，筛选致病性结构变异，是将纳米孔测序技术由基础研究转为临床检测的重要过程。一项405例中国人口的结构变异与其表型、疾病和群体的关系的研究率先阐明了结构变异在我国人群基因组不同位置的分布特点和人群特征[3]，该研究对临床上筛选结构变异导致的疾病提供了巨大的帮助。本研究拟对比纳米孔测序与染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)2种检测方法，分析1例复杂结构变异的非梗阻性无精症病例，评价纳米孔测序在复杂结构变异检测的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1标本来源 收集2019年3月于南京市妇幼保健院诊断为染色体平衡易位的非梗阻性无精症患者外周血标本1例(南京市妇幼保健院科研伦理委员会批准文号：[2019] KY-081)。该男性患者年龄27岁，婚后正常性生活3年不育，查体排除其他基础疾病，Y染色体微缺失检查结果正常，精液和睾丸穿刺液中未检出生殖细胞。

1.2主要仪器和试剂 人类外周血提取试剂盒(Cat#13323，德国凯杰公司)，纳米孔测序系统及配套的建库测序试剂盒(SQK-LSK109，英国纳米孔测序公司)。微量分光光度计(Nanodrop 2000，美国赛默飞公司)，荧光定量仪(Qubit 3.0，美国Invitrogen公司)，染色体微阵列芯片扫描仪Affymetrix GeneChip system 3000、染色体微阵列芯片CytoScan HD(美国昂飞公司)，自动化DNA片段回收系统(BluePippin system，美国Sage Science公司)，高通量测序仪(PromethION，英国ONT公司)。

1.3染色体微阵列试验 取该患者300 μL外周血提取DNA，根据染色体微阵列试验流程(美国昂飞公司)进行试验，主要包括基因组DNA的消化、连接和PCR，对PCR产物纯化后进行片段化，随后进行标记和杂交，最后进行洗脱、染色和扫描。染色体微阵列使用CytoScan HD芯片。使用Chromosome_Analysis_Suite_4.0软件进行数据处理和分析。

1.4纳米孔测序试验 取2 mL外周血，提取约2 μg DNA(A260 nm/A280 nm值为1.8～2.0，A260 nm/A230 nm值为2.0～2.2)。通过BluePippin自动化DNA片段回收系统筛选≥15 kb的DNA片段，纯化后根据纳米孔测序系统及配套的建库测序试剂盒说明书完成建库和上机测序过程，期间清洗1次测序芯片，获得更大的数据量。

1.5数据分析 测序时，通过Guppy(4.5.3)将FASTA5数据实时转换成FASTQ数据，随后以GRCh37人类参考基因组为参考序列，通过Minimap2(2.17)软件对FASTQ数据进行序列比对。使用Sniffles[10](1.0.12)、Nanovar[11](1.3.2)、cuteSV[12](1.010)3种软件分别对上述数据进行结构变异查找，包括：缺失(DEL)、插入(INS)、重复(DUP)、倒位(INV)、易位(TRA)，汇总后使用AnnotSV(2.2)对结构变异进行注释。

1.6PCR鉴定 根据纳米孔测序所得结构变异位置,使用primer3web(https://primer3.ut.ee/)软件设计引物，通过PCR扩增结构变异区域并进行Sanger测序,确定断裂段碱基序列信息，验证纳米孔测序发现该结构变异的准确性。引物见表1。

表1 Sanger测序引物

2 结果

2.1患者临床信息 患者排除囊性纤维症CFTR基因突变、生殖内分泌异常(雄激素不敏感等)、抗精子抗体阳性、睾丸发育异常(隐睾、先天性无睾症)、双侧睾丸炎、双侧睾丸扭转、双侧精索静脉曲张、肿瘤、药物或毒素、创伤及环境危害等因素，Y染色体AZF a、b、c区域结果均正常，后经外周血染色体G显带核型分析发现该患者核型为46,XY,t(1;3)(q21;q27)，属于染色体结构变异(图1)，但该结构变异的致病性尚未可知。

注：红色箭头所示为发生平衡易位的2条染色体。

2.2染色体微阵列结果 按照美国医学遗传学会指南(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)，染色体微阵列分析发现9个临床意义不明的染色体拷贝数变异(VOUS)，3个纯合子状态区段 (regions of homozygosity, ROH，表2)以及15q15.3区段缺失(图2)，内含PPIP5K1、CKMT1B、STRC、CATSPER2共计4个OMIM基因，可能与隐性遗传方式的15q15.3缺失引起的STRC相关听力障碍有关[13]，此患者为携带者。经过数据分析和数据库比对：(1)根据ACMG判读，以上拷贝数变异被判定为VOUS；(2)15q15.3区段126 kb缺失影响的3个基因(PPIP5K1、CKMT1B、STRC)在OMIM数据库中无精子发生相关报道，CATSPER2在精子运动中起着至关重要的作用，该基因的缺失会引起严重的弱畸形精子症[14-15]，但在本病例中为杂合性缺失并不致病。

表2 染色体微阵列分析结果

注：Weighted Log2 Ratio，Log2比率加权值；Copy Number State，拷贝数状态；LOH(segments)，杂合性缺失；Allele Difference，等位基因差异；BAF，B等位基因频率。

2.3纳米孔测序结果 下机数据通过NanoPlot质量控制后，平均读长为18 259.8 bp，平均测序质量为13.4，N50长度为24 816.0 bp。本研究中Sniffles、NanoVar和CuteSV 3种工具均鉴定出的12 053个结构变异为高可信度变异(图3A)，其中缺失6 260个、插入5 624个、重复115个、倒位22个、易位32个(图3B)。此外，通过AnnotSV对测序结果进行注释，发现结构变异在基因组中的分布如下：UTR区782个，Exon区3 796个，Intron区957个，其他区域24个，影响2 406个基因。与染色体核型结果相比，纳米孔测序精确定位了该结构变异的断裂点位置分别位于chr1:156329779-156333071和chr3:191595575。根据断裂端人为将1号染色体分为A、B、C、D 4个区域，3号染色体分为E、F 2个区域(图3C)。结果显示，在1号染色体B区缺失3 198 bp(图3D)，C区与A区拼接。因此，通过对序列分析，针对2个断裂区域设计引物进行PCR扩增并Sanger测序，结果确认1号染色体长臂存在3 198 bp缺失，最终形成新的1号衍生染色体。3号染色体断裂段与1号染色体D区拼接后，形成新的3号衍生染色体(图3C、3E)。综上，将该不育男性患者复杂的染色体结构变异更加精准地描述为：Seq[GRCh37]t(1;3)(q21;q27)g.[chr1:pter_cen_156329779:cher1:156332977-156333069:chr3:191595582_qter]g.[chr3:pter_cen_191595574:chr1:156333071_qter]。

注：A，3种结构变异分析软件韦恩图；B，取交集后结构变异不同类型占比；C，染色体复杂结构变异地铁模式图；D，IGV发现1号染色体存在3 198 bp缺失；E，平衡易位断裂点Sanger测序峰形图。

3 讨论

CMA是近些年临床常用的高分辨率全基因组检测技术，对于多数染色体的拷贝数变异、微缺失和重复的检出能力较强[16]。在拷贝数变异和大片段缺失的情况下建议使用CMA检测，而在本病例中发现15q15.3区段缺失，其中就包括新发现的STRC听力障碍杂合缺失。但鉴于探针数目和分布的限制，该方法并没有检出1号染色体3 198 bp缺失，因此，该方法结果为阴性并不能排除在无探针区域的染色体异常，需用其他检测手段弥补。

笔者通过对1例非梗阻性无精症外周血染色体G显带核型分析、CMA和纳米孔测序等技术分析后证实，纳米孔测序技术验证了CMA发现的15q15.3区段缺失片段大小为126 kb，包括PPIP5K1、CKMT1B、STRC和CATSPER2基因；明确了染色体核型为46,XY,t(1;3)(q22;q28)，并进一步明确断裂点处的精确位置和影响基因，包括TSACC、RHBG和FGF12；此外，在平衡易位中还发现了1号染色体存在3 198 bp缺失以及5 559个能够被注释的结构变异。以上结果提示，基于纳米孔测序鉴定出的结构变异影响的基因可能成为明确该名非梗阻性无精症患者致病原因的重要补充手段，但基于目前的数据分析能力和对结构变异的解读能力，笔者没能找到该男性不育的致病基因。

通常在染色体G显带结果提示受检者染色体存在结构变异，而CMA结果无法解释致病原因的情况下，纳米孔测序在重构复杂结构变异的染色体，寻找断裂点及其影响的基因等方面具有明显优势，我国人群[3]以及国外人群[1]的结构变异数据库已经建立，但是对于纳米孔测序技术得到的一万多个结构变异的解读仍然存在很大的困难。随着Cas9介导的目标片段富集技术和Read Until程序算法的不断发展，使得目标区域靶向测序成为可能，而这项技术的发展将为人群遗传疾病的精准检测奠定基础。相信在不久的将来，随着纳米孔测序准确度和深度的提升，人类基因组目标区域定制测序的时代即将到来。