RNAi生物农药在作物保护上的应用

莫 芹,徐莉莉,吕贝贝*

(1上海市农业科学院生物技术研究所,上海 201106;2上海市农业遗传育种重点实验室,上海 201106;3上海市农业技术推广服务中心,上海 201799)

为了应对全球环境变化和病虫侵害给农作物生产和粮食安全带来的挑战,现代农业生物技术在保证农作物产量、品质等方面起了重要的作用。在这些技术中,RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术被认为是农业绿色防控中最具有应用潜力的生物技术之一[1-3]。该技术具有高效性、特异性和可传播性等特点,通过特定的设计,由植物表达或其他方式制备获得的RNAi生物农药可以高特异性地抑制危害植物的真核微生物或无脊椎动物关键基因表达,从而达到控制病虫害的效果[4]。

目前RNAi技术已经被广泛应用于植物发育、种质改良和病虫害防控等方面[5]。基于RNAi开发的生物农药可以预期以转化和非转化产品形式进入市场。转化形式的第一个产品是美国孟山都公司研发的抗虫转基因玉米SmartStax®PRO品种,已经于2017年在美国和加拿大相继获得了商业化种植的许可[6]。非转化形式的产品可以通过喷洒、茎注射、蘸根、种子处理等形式进行RNA制剂的局部施用。尽管目前没有此类形式的产品上市,但随着真核生物RNAi机制的逐步解析,生产成本及功效进一步改善,此类新型生物农药也将在害虫防治领域发挥越来越重要的作用。与传统化学农药相比,该技术是一种通用的、环境友好的农业病虫害防控策略。此外,该技术结合其他育种技术和生物农药技术,能够减少农业对于化学合成农药的依赖,为未来农业的可持续发展保驾护航[2]。

1 RNA干扰技术

1.1 RNAi简介

RNAi是指通过双链(dsRNA)或发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)诱导的真核生物同源mRNA降解,从而下调基因表达的生物学现象[7]。RNAi作为一种转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing,PTGS)机制,是一种真核生物中普遍存在的古老的基因表达调控机制,参与了宿主对病毒的防御,对染色体和基因组完整性的维护等重要的生物学过程[8]。该机制的触发因子是由外源或者内源产生的双链RNA(dsRNA),通过dsRNA诱导使同源mRNA发生高效特异性的降解,从而达到序列特异性的转录后基因沉默效果。这种触发因子可能由基因组自身因为反向互补结构产生,也可能是因外源微生物(如病毒)入侵导入的,因此RNAi也是生物体抵抗外界生物侵染,保护自身遗传物质稳定的天然免疫模式[9-10]。

利用RNAi技术可以特异性地下调特定基因的表达,该方法相对于基因编辑技术来说易于实现、操作简便,特异性高,因此它是真核生物遗传学、功能基因组学等研究的有效工具,目前已经应用于动植物基因功能的探索、植物病虫害防治、流行病和基因治疗等研究领域[11-13]。

1.2 RNAi的放大效应

大量的mRNA转录后降解是真核细胞基因转录后调控的重要手段,RNAi机制最终结果也是导致mRNA的降解,从而在转录后水平上沉默基因的表达。转录后mRNA自然降解和RNAi的主要区别是RNAi过程中形成的初级小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能够造成下一轮的mRNA降解,从而形成逐级放大的循环效果[14]。基于对模式植物拟南芥的研究,科学家们总结了植物RNAi循环机制,示意图如图1所示[15-16]。植物中的ARGONAUTE(AGO)蛋白家族(拟南芥中主要为AGO1和AGO2)能够以mRNA为靶标,在初级siRNA或microRNA的序列互补引导下进行切割;接着RNA依赖型的RNA聚合酶6(RNA-dependent RNA polymerase 6,RDRP 6)识别切割后的mRNA并产生双链RNA(dsRNA);产生的dsRNA被DICER-LIKE家族蛋白DCL2和DCL4切割成次级siRNA;最后,次级siRNA又可以进入AGO1,并针对额外的mRNA进行切割,导致其RNAi形成循环机制,从而放大转录后基因沉默的效果。在线虫、真菌和植物中存在基于RDRP的信号放大途径[17-18]。由Dicer剪切后的siRNA在RDRP的作用下能够以siRNA反义链为引物,以靶mRNA作为模板合成新的dsRNA,再次加入到RNAi通路从而逐级放大基因沉默效果。因此在这些生物体内只需要很少的siRNA即可以引发RNAi效应。

图1 植物RNAi机制示意图Fig.1 Schematic diagram of RNAi machinery in plants

2 植物中RNA干扰的作用机制

植物中存在大量的小RNA分子,它们在植物基因的调控、转座子的防御,以及病毒活性的控制等方面具有重要作用。这些小RNA分子主要由4种途径产生:微小RNA途径、反式作用小干扰RNA途径、RNA介导的DNA甲基化途径,以及由外源核酸诱导的RNA沉默途径,这4种途径有部分重叠但功能分明[19]。前三种途径的小RNA分子均来源于宿主本身,与宿主代谢调节和维持遗传物质稳定性相关,第四种外源核酸分子来源包括病毒和转基因,与植物抗病毒免疫途径相关。RNAi技术用于病虫害防治的主要机理是基于第四种途径进行设计的,因此这里主要讨论抗病毒RNAi和正义转基因诱导的RNAi两方面的机制研究。RNAi的触发因子是dsRNA,已有研究表明,病毒的RNA基因组或转录本复制导致了dsRNA的产生,这在RNAi机制中发挥了重要作用[20]。入侵的核酸分子还包括由含有表达盒的转基因作物产生的dsRNA。事实上大多数我们所了解的内源siRNA途径也是来自于以正义转基因和病毒为模型的研究[19]。

2.1 抗病毒RNAi

RNAi已经被认为是植物的一种天然抗病毒防御机制。任何类型的病毒或亚病毒因子感染植物都与病毒小RNA分子的积累有关,这些RNA是从病毒双链RNA加工而来,并使用相同的宿主植物siRNA生物合成机制,利用AGO蛋白指导降解单链病毒RNA。因此病毒既是siRNA途径的诱发剂又是靶标。

来源于RNA病毒的siRNA主要被DCL4蛋白加工,也有部分被DCL2蛋白加工,最终生成的siRNA大小以21nt为主,也有部分为22 nt[21]。在正链和负链病毒基因组RNA之间形成的dsRNA,以及在单链病毒基因组RNA内形成的茎环结构,都被认为是病毒siRNA的前体[22]。对于DNA病毒来说,基因组复制和RNA转录发生在宿主植物细胞的细胞核内,因此细胞核的DCL3蛋白也参与处理DNA病毒产生siRNA(大小为24 nt)的过程。这些24 nt的病毒siRNA可以引导RdDM到DNA病毒基因组,导致病毒基因启动子的DNA甲基化以及病毒基因的转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)[23]。因此包括RNAi的PTGS途径和TGS途径都参与到植物抵抗DNA病毒的过程。

2.2 正义转基因诱导的RNAi

正义转基因的RNAi需要植物中RDRP6、DCL4、SGS3和AGO1等蛋白参与其传递性和系统性两个方面,都涉及主要靶基因以外区域21 nt siRNA的产生,这说明次级siRNA是PTGS途径的重要成分。来自于转基因的异常RNA转录本是PTGS途径的有效触发因子,植物基因组上的多拷贝、含有倒置重复序列的基因片段在读码转录后可以产生发夹结构的RNA(hpRNA)。由这些初级dsRNA或hpRNA加工而成的siRNA要么本身就能诱导出完整的RNAi,要么更有可能触发次级siRNA的产生,从而导致全面的RNAi[24]。总之,dsRNA/hpRNA经过植物的RNAi机制产生的小RNA分子(包括miRNA和siRNA),它们能够在转录后水平和转录水平两方面起调控基因表达的作用,但其中的详细机制目前尚不能明确区分。

3 RNA干扰技术在作物保护上的应用形式

根据dsRNA的来源不同,RNAi在农业上的应用主要有3种表现形式:第1种是以宿主表达的dsRNA诱导基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)。病原微生物或害虫在侵染作物时,会摄入宿主表达的靶标dsRNA分子,从而干扰了病原微生物或害虫的关键靶标基因的表达,影响其生长发育,进而达到防治效果。第2种是以病毒或者细菌等微生物载体表达的dsRNA诱导的基因沉默(Vector-mediated gene silencing,VMGS)。该方法通常选用中性病毒载体或者植物内生菌作为dsRNA的表达和运送载体。第3种是外源dsRNA诱导的基因沉默(Exogenous dsRNA-induced gene silencing,EdIGS)。EdIGS与传统农药的使用方法最为相似,但dsRNA分子的稳定性是该技术能否有效的关键。三种形式的dsRNA传递形式不同,其应用效果也存在不同的优缺点(表1)。

表1 3种RNAi表现形式优缺点比较Table 1 Advantages and drawbacks of three RNAi performances

3.1 HIGS

传统的病虫害抗性品系的筛选需要花费大量的人力和时间,而且筛选效率低。为了克服抗性品种的局限性,HIGS作为现代生物育种技术之一,被广泛应用于生产抗各种病虫害的作物。迄今为止,已经发表了170多项HIGS研究,相应的产品也已经推出[25],如抗病毒和病原真菌的香蕉品种、抗条锈病的转基因小麦品种以及第三代具有根虫抗性性状的玉米品种MON 87411等[6,26-27]。

通过转基因的途径实现RNAi应用的研究较早,该方法需要制备dsRNA/hpRNA结构,并生成稳定遗传的转基因植株品系,能够持续合成RNAi的诱发因子,因此能够获得持续的病虫害抗性,种植生产时不需要额外的病虫害管理。HIGS技术是植物病害防控中最有前景的转基因技术之一,通常是针对效应子基因或者关键管家基因的沉默,目前在病毒和谷物枯萎病防治方面已有大量研究报道[28-30]。然而,基于HIGS技术抗性转基因植株的获得高度依赖于目标作物的可转化性和遗传稳定性,通常需要很长的时间。此外,尽管科学证明长dsRNA不会导致饮食危险,消费者对转基因作物和产品的接受度仍然限制了该方法的发展[31]。目前在我国可以种植的RNAi作物只有转基因木瓜,它是采用HIGS技术将木瓜环斑病毒的基因导入到木瓜中,用来防控严重影响木瓜产量的环斑病毒,目前市面上90%的木瓜均是以这种技术保障其产量的[32]。

3.2 VMGS

鉴于跨系统RNAi(trans-kingdom RNAi)途径能够使RNAi在微生物组或者微生物个体和宿主之间转移,利用病毒或者内生菌载体的策略被认为是一种折中可行的RNAi传递方式[33]。利用病毒载体在植物中表达异源基因是实验室中的常规操作,但这些载体通常只能用于短期实验或者生产一些特殊的产品。开发常年存在于植物中的病毒载体能够在植物中持续稳定地表达异源基因。结合构建含有RNAi靶序列的病毒载体的方法,能够帮助实现植物病害防治的田间应用,例如对于柑橘毁灭性病害——黄龙病的治理。柑橘黄龙病是公认的难治病害,由亚洲韧皮杆菌侵染所引起的,其传播载体是亚洲柑橘木虱。研究学者通过在韧皮部接种含有亚洲柑橘木虱部分异常翼盘基因(Asd)的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),能够有效控制病菌传播载体(亚洲柑橘木虱)的数量,从而进一步有效控制柑橘黄龙病的传播[34]。

利用细菌载体传递dsRNA/hpRNA在模式昆虫和哺乳动物的基因功能研究中已有先例。RNAi的发现之初,Fire等[35]就发现表达dsRNA的大肠杆菌可以对以其为食的线虫幼虫产生特定的干扰作用。在线虫的基因功能研究中相对于显微注射、浸泡、转基因植物等dsRNA传递方式,通过喂食表达dsRNA的大肠杆菌的方式具有简便、成本低、可操作性强等优点,目前利用非病原细菌传递RNAi已经成为取食性昆虫基因功能研究的重要手段之一[36]。利用细菌工程菌/病毒载体的RNAi生物农药,也可以作为一种选择性、环保型杀菌剂,用于植物病虫害的防治。研究表明,通过饲喂表达特定靶标基因dsRNA的大肠杆菌能够防控多种害虫的危害,例如给鳞翅目害虫甜菜夜蛾和东方粘虫饲喂表达几丁质合成酶基因(SeCHSA)dsRNA的大肠杆菌,会干扰其幼虫的生长发育,导致其致死[37-38]。危害全球杨柳科植物的鞘翅目害虫柳蓝叶甲通过大肠杆菌介导的RNAi也能得到有效的防控[39]。

3.3 EdIGS

由这种形式开发的生物农药与传统农药类似,主要以非转化形式(喷施、茎注射、蘸根、种子包衣剂等)的产品上市。该方法以非转基因方式激发植物的RNAi机制,能够获得政府监管和消费者的认可。目前为止,dsRNA的外源性应用已经有效地触发了植物基因、病毒、真菌、昆虫和螨虫的RNAi,在植物保护和生物育种等方面具有广泛的应用范围和开发潜力[40]。植物中SIGS的影响因素主要包括4种:dsRNA的质量(包括长度和浓度)、施用方法、传递方法和植物器官的敏感度[41]。实验证明,外源应用22 nt siRNA是植物中局部和全身性RNAi最有效的诱导剂。将RNA分子结合到纳米粒子和载体肽中,极大地提高了它们对核酸酶的抗性和传递效率[42]。高压喷雾可使外源RNA共质体传递,而叶柄吸收和/或主干注射则导致外源RNA外质体传递[43-44]。以上施用和传递技术已经在实验室中取得成功,但也应该注意到高新技术的成本问题。综合来看SIGS方式在农业大田应用中的主要挑战是dsRNA的合成成本和dsRNA的稳定性问题。通过工程微生物表达dsRNA的方式能够一定程度上降低dsRNA合成成本[45-47]。随着市场对dsRNA的兴趣不断增长,推动了更好的生产系统、高效配方的发展,并将其成本从2008年的每克12 500美元降至2017年9月的每克近2美元。虽然还缺乏实地试验,但dsRNA的需求量预计为2—10 g/hm2[48]。

4 总结与展望

为了应对全球环境变化和人口增长的压力,粮食安全问题迫切需要新的可持续的技术保驾护航。在农业绿色防控领域,RNAi技术被认为是一项公认的具有前景的作物病虫害防治工具。该技术主要以HIGS、VMGS和EdIGS三种形式应用,目前在病毒、真菌、昆虫、线虫等多种病虫害防治中均有应用研究。其中以HIGS策略开发的转基因产品被认为是继Bt技术后的第三代抗虫生物农药,它能够缓解昆虫抗药性压力,延长以基于Bt蛋白技术的转基因农作物的使用寿命。

以HIGS形式的RNAi目前已有产品应用,但该产品通过转基因植物的方式上市,因此政府监管部门和社会对其施加了一定的压力,建立配套推广的安全性评价体系刻不容缓[49-50]。而以VMGS和EdIGS形式开发的产品目前仍然在基础研究阶段,这两种应用形式的基础机制仍然有很多未得到清晰的解析,比如涉及靶标和宿主之前的跨界RNAi(cross-kindom RNAi)机制,这也是限制其应用的主要因素之一[51]。同时,为了实现基于RNAi生物农药在农作物保护上的推广与田间应用,我们也需要进一步了解RNAi的分子机制(包括宿主和靶标RNAi机制的贡献和特异性,以及RNAi触发分子的摄取和转运等),从而合理评估该技术未来田间应用的稳定性、特异性、持久性以及相应的可能性风险。