全自动固相萃取-气相色谱质谱联用测定酿造用水中的20种农药残留

黄 箭，谢正敏，安明哲，魏金萍，张 倩，薛润萍

（宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644000）

我国是农业大国，是生产和使用农药最多的国家。随着农业的发展，农药被广泛应用于现代农业的生产中，常见的农药种类包括有机氯、有机磷、拟除虫菊酯类以及氨基甲酸酯类等，其作用是消灭、控制或预防危及农业的病、虫害、杂草等有害物质。我国每年使用农药高达上百种，使用量高达百余万吨，但只有30 %左右的农药能够被利用，大量未被利用的农药通过降雨、地表径流等方式进入水环境污染水源，对生态环境和人类健康带来潜在的危害。据相关文献报道，水环境中主要农药污染物为有机氯农药（organochlorine pesticides，OCPs）和有机磷农药（organophosphorus pesticides，OPPs）。Pan 等调查发现长江流域中间段地下水中农药含量OCPs 含量最高；Gao 等对我国淡水流域地表水中农药残留调查发现OPPs 含量高于OCPs。研究表明，水环境中主要OCPs 是六六六（hexachlorocyclohexane，HCH）和滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）。农业部自颁布《到2020 年农药使用量零增长行动方案》后，OPPs 的施用量虽有所下降，但是敌敌畏、毒死蜱和马拉硫磷等OPPs 每年的使用量仍达到1000～30000 t，导致水环境中不断有OPPs检出。

古人云“水乃酒之魂”，水是酒的主要成分之一，不管是利用传统技术酿酒还是现代新工艺技术酿酒，水质决定了酒质，水质的好坏直接影响着酒的质量。所谓名酒产地，必有佳泉，传统经验认为只有洁净的泉水才能酿出醇香的美酒，许多名优酒厂均选建在有良好水源的地方。酿造用水中所含的各种成分，都与微生物的生长、酶的形成、糟醅的发酵以及成品酒的质量息息相关。水中的农药残留会对白酒的食品安全造成潜在的风险，因此建立酿造用水中农药残留的检测方法至关重要。

目前，国内外对农药残留的检测方法有很多，主要有气相色谱法（gas chromatography，GC）、气相色谱质谱法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）和液相色谱质谱联用法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）。水环境中农药残留检测最常用的前处理方法有液液萃取（liquid liquid extraction，LLE）和固相萃取（solid phase extraction，SPE）。液液萃取通常需要使用大量的有机溶剂，且对环境污染较大，样品的重现性较差；固相萃取可以将农药的萃取、浓缩、选样等多种功能技术汇集于一体，从而大幅度地优化和提升萃取工作效率，同时溶剂使用量少，有利于实现自动化和标准化。由于水中农残的含量较低，通常选用固相萃取来对水中的农药残留进行富集、浓缩来提高目标物的检出限。实验采用全自动固相萃取方式进行前处理，并进一步优化实验条件，建立气相色谱-质谱联用对酿造用水中20 种农药残留的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

农药标准品：敌敌畏、α-六六六、乐果、呋喃丹、β-六六六、γ-六六六、五氯硝基苯、δ-六六六、甲基对硫磷、七氯、马拉硫磷、艾氏剂、毒死蜱、对硫磷、狄氏剂、P,P'-滴滴涕（P,P'-DDT）、异狄氏剂、O,P'-滴滴涕（O,P'-DDT）、P,P'-滴滴伊（P,P'-DDE）、P,P'-滴滴滴（P,P'-DDD），质量浓度为100 μg/mL 的单标准溶液,北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司。

试剂：乙酸乙酯（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；二氯甲烷（色谱纯），西陇化工股份有限公司；正己烷（色谱纯），甲醇（色谱纯），德国Merck 公司；CNWBOND LC-C柱（500 mg/6 mL），Poly-Sery HLB Pro 柱（200 mg/6 mL），上海安谱实验有限公司；无水硫酸钠，成都科隆化学品有限公司。

仪器设备：7890B-7000C 气相色谱质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；Fotector plus60 全自动固相萃取仪，AUTO EVA60 全自动浓缩仪，睿科仪器有限公司；milli-Q纯水机,密理博有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 农残混合标液的配制

准确量取质量浓度为100 μg/mL 的有机磷、呋喃丹、狄氏剂、异狄氏剂各200 μL，其余农药各100 μL于10 mL的棕色容量瓶中，加入乙酸乙酯定容，混匀后得部分农残质量浓度为2 μg/mL，其余为1 μg/mL 的混合标准储备液。混合标准工作液的配制：采用逐级稀释法配制不同浓度的农残混合标准工作液，用空白基质将农残混标储备液稀释成1 μg/L、3 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的混合标准工作液。

1.2.2 气相色谱-质谱条件

气相色谱条件：HP-5MS 毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气为氦气（纯度≥99.999 %），流速1 mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL；柱温：起始温度60 ℃，保持1 min，以25 ℃/min 升至180 ℃，保持0.5 min，以2 ℃/min 升至190 ℃，1 ℃/min 升至195 ℃，再以5 ℃/min 升至230 ℃，最后以20 ℃/min 升至280 ℃，保持2 min；进样口温度：250 ℃；辅助加热温度280 ℃。

质谱条件：采用EI多反应监测模式（MRM），溶剂延迟：5 min，离子源温度：230 ℃，四级杆1 温度：150 ℃，四级杆2温度：150 ℃，碰撞气为高纯氮气。

1.2.3 水样前处理

体育旅游以其较强的参与性、灵活性和娱乐性等特点，延伸出纷繁多彩的新形式。而传统的观光旅游也正在逐步向体验式旅游转变[1]，体育赛事活动、体育场（馆）服务业、体育健身休闲以及体育用品制造等与旅游产业相结合，形成“赛事型体育旅游”“运动休闲型体育旅游”等特定形式的体育旅游地。当前，我国体育特色小镇正以“体育+旅游”的主要模式蓬勃发展。

将取回的水样置于棕色玻璃瓶中，按照水样∶甲醇=100∶1 的比例在水中加入甲醇作为稳定剂。待测水样用0.25 μm 滤膜过滤，置于4 ℃冰箱中保存，于7 d 内进行萃取。取经过滤后的水样500 mL以10 mL/min的速度通过HLB萃取柱。水样萃取完成后，用氮气吹干SPE小柱，用10 mL乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1）分两次淋洗（详情见表1），再用5 mL 乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1）润洗样品瓶，合并洗脱液，用无水硫酸钠除水后氮吹至近干，用混合液定容至1 mL，待仪器测定。

表1 全自动固相萃取流程

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

由于化合物的种类较多，各化合物对质谱的响应差别较大，根据目标农残在质谱上响应的差异，首先配制高浓度的农残混合标样进行质谱全扫描分析，确定各物质的保留时间后，逐个分析其质谱图，比较每一种化合物产生的碎片离子的相对丰度，选择丰度较高、干扰较小的离子作为母离子进行子离子扫描，优化对应的电离能，在不同的电离情况下确定各个化合物响应最佳的碎片离子，选择响应较好的两个子离子作为定量离子和辅助定性离子，通过以上方法确定20 种目标农残的MRM 离子对信息，见表2，实验为使各农残在质谱上响应强度相近，配制了不同浓度的混合标准溶液，由此获得的质谱图见图1，图1 有机磷、呋喃丹、艾氏剂、狄氏剂配置为20 μg/L，其余农药为10 μg/L 的混合标准溶液。

图1 20种农药标样的MRM图

表2 20种农药的保留时间及离子对参数

2.2 固相萃取条件的优化

2.2.1 固相萃取柱的选择

固相萃取柱的萃取效率对样品的检测极为重要，决定萃取效果的是SPE 小柱填充剂的类型、上样速度以及洗脱溶剂的种类及流速，本研究所需富集的目标农残主要为有机氯和有机磷两类，有机氯基本都是非极性化合物，有机磷多为中等级性化合物，根据目标农残的类型，方法选用C柱和HLB柱，均为反相柱，适用于非极性至中等极性的化合物的富集。由图2 可知，C柱对20 种农残的回收率范围为29.4 %～114.11 %，平均回收率为93.81 %；HLB 小柱对20 种农残的回收率范围为55.91 %～102.31 %，平均回收率为87.64 %。其中乐果回收率HLB 柱可达95.51 %，C柱为29.4 %，这与有关研究的C对水中乐果的回收率高达80%以上不符，艾氏剂的回收率只有60%左右，其他回收率均在70%～110%之间，且两根小柱的回收率相差不大。为保证多数农残的回收率，选择HLB小柱为萃取小柱。

图2 不同小柱对目标农残的回收率比较

2.2.2 洗脱液的选择

图3 不同混合溶剂对目标农残洗脱效率的影响

2.2.3 水样pH值的选择

据相关文献报道，有机磷农药在中性或酸性条件下较稳定，在碱性条件下易发生降解，研究将水样pH 值用盐酸调节至2～3，同时对照组不调节pH值，采用全自动固相萃取仪对水样进行富集，经洗脱、浓缩后进行检测。结果表明，水样pH 值对目标农残的回收率影响较小，将水样pH 值调至酸性对回收率并没有较大的改善作用。

2.3 基质效应

基质效应的存在会对目标组分的信号产生增强或者抑制效应，基质效应（ME=B/A，A 为纯溶剂中农药的响应值，B 为样品基质中添加的相同含量农药的响应值）比值在0.9 和1.1 之间，表示基质效应可以忽略，大于1.2 为基质效应增强，小于0.9 为基质效应减弱。研究用经mili-Q 处理过的超纯水进行加标实验，发现基质效应对部分农残回收率的影响较大，均为基质增强效应，分别计算了用基质配标和溶剂配标的回收率，见图4—图5。结果表明，若用溶剂配标去计算样品加标回收率，结果普遍高于100 %，其中乐果、呋喃丹、马拉硫磷、异狄氏剂的回收率均大于120%，呋喃丹回收率达200%以上，马拉硫磷回收率高达180%，其他农残的基质效应可以忽略，而用基质配标回收率均在70 %～110 %之间。赵丽在对生活饮用水中14种农药残留检测中用C8、PEP柱进行加标回收时部分农残回收率高达300%，这是忽略了基质效应对农药的影响，因此用基质配标进行加标回收的计算更为准确。

图4 溶剂配标和基质配标的色谱对比图

图5 基质配标和溶剂配标对加标样回收率的影响

2.5 回归方程、线性范围和检出限

取标准系列溶液按上述条件进行进样分析，分别以每种标样的浓度（x，μg/L）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，在1～200 μg/L 范围内20 种农药线性良好，相关系数R≥0.993。方法的检出限（limit of detection，LOD）以3倍信噪比（S/N=3）计算，定量限（limit of quantitation，LOQ）以S/N=10计算，结果见表3。

表3 20种农残的线性回归方程、相关系数(R2)、检出限和定量限

2.6 加标回收率

在500 mL 空白水样中加入目标农残，添加浓度分别为50 ng/L、100 ng/L、200 ng/L，每个浓度水平平行6 次，按优化条件处理并分析水样，回收率及精密度见表4。除七氯和艾氏剂外，其他18 种农残平均回收率在81.57 %～115.91 %之间，RSD 在4%～13%之间，均在允许偏差内。

表4 不同加标水平的回收率和相对标准偏差RSD(%，n=6)

2.7 样品检测

采用优化后的参数对车间酿酒用水进行农残检测，除敌敌畏、α-六六六、呋喃丹、γ-六六六、δ-六六六、对硫磷以外，其余农残均有检出，含量为0.003～0.021 μg/L，均低于国标限量标准。

3 结论

本研究通过全自动固相萃取-气相色谱质谱联用仪，建立了酿造用水中20 种常见农残检测方法。在拟定的实验条件下，20种农药得到了较好的分离，除艾氏剂、七氯外，其他农残的方法检测限、回收率和灵敏度均满足痕量农残分析技术要求。实验表明，艾氏剂和七氯用C小柱的回收率比HLB小柱富集的回收率高，其他农残的回收率均不及HLB 小柱，综合其他农残的回收率选择了HLB小柱，这可能是其回收率偏低的原因。该法相比于传统的液液萃取，能有效富集水中的有机物，克服了传统液液萃取中试剂用量大、污染环境、回收率不高等缺点，同时节约了人工，能完全实现样品预处理的自动化操作。