妃子笑荔枝LcSAI 启动子的克隆及其生物信息学分析

董 晨，李金枝，郑雪文，王 弋，李伟才

（中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/农业农村部热带果树生物学重点实验室，广东 湛江 524091）

【研究意义】荔枝（Litchi chinensisSonn.）是岭南名贵水果，有“岭南果王”之美誉。荔枝是典型的糖直接积累型果实，含糖量是优质荔枝品种的重要指标之一。不同荔枝品种积累的主要糖分不同，如妃子笑和黑叶荔枝以积累还原糖为主，无核荔和糯米糍荔枝则以积累蔗糖为主［1］。不同品种荔枝的糖分构成不同，其实质是不同酶系统调控的结果，而酶系统及其活性与基因表达相关［2］。蔗糖代谢相关酶活性与蔗糖积累密切相关，而转化酶是调节蔗糖代谢的关键酶之一，转化酶将蔗糖分解为还原糖和果糖，在蔗糖的转运、贮藏和分配中起重要作用［3］。根据最适pH 值，转化酶可分酸性转化酶（AI）和碱性转化酶（NI）；根据定位，酸性转化酶又分为可溶性酸性转化酶（SAI）和细胞壁酸性转化酶（CWAI）［4］。可溶性酸性转化酶是一种液泡酶，能调控液泡的库活力，对外界胁迫、激素和细胞伸长等都有一定作用［5-9］；细胞壁酸性转化酶主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，以保持库-源之间蔗糖的浓度梯度，在调控植物衰老及果实发育中起重要作用［10］。

【前人研究进展】酸性转化酶能显著调控果实成熟期的糖组分。如在香蕉果实成熟过程中酸性转化酶能显著调节蔗糖与还原糖的比值［11］；菠萝蜜果实发育过程中，随着转化酶活性增强，蔗糖含量随之减少，且不同品种中转化酶活性存在差异［12-13］。在葡萄、荔枝、甘蔗等作物中，转化酶基因表达量越高，转化酶活性越高，伴随着蔗糖含量越少且还原糖含量升高，反之亦然［14-15］。研究表明，以积累蔗糖为主的糯米糍等荔枝在果实成熟过程中几乎检测不到酸性转化酶活性，而积累还原糖为主的妃子笑等则保持较高的酸性转化酶活性［16］。还原糖积累型果实酸性转化酶基因的表达量显著上调，而在蔗糖积累型果实中该基因表达量很低。【本研究切入点】基因表达由上游调控因子调节，启动子决定特定基因的表达。因此，克隆并分析酸性转化酶基因的启动子，对深入了解荔枝不同糖积累类型的调控机理具有重要意义。但目前尚未见有关荔枝酸性转化酶基因LcSAI启动子的相关报道。【拟解决的关键问题】本研究通过克隆荔枝LcSAI启动子，利用生物信息学分析工具对LcSAI启动子中可能的转录起始位点、顺式作用元件、CpG 岛等进行分析，以期为今后深入研究荔枝生产中的品质调控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试荔枝品种为妃子笑，2021 年5 月下旬采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所荔枝种植园，取成熟妃子笑果肉作为基因组DNA 的提取材料。

DNA 提取试剂盒Easypure Plant Genomic DNA Kit、pEASY-T1 载体和大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司。所用仪器主要有Eppendorf 离心机、Germany 超微量分光光度计、Thermo Fisher Scientific PCR 仪。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA 提取 按照DNA 提取试剂盒说明书的方法提取荔枝基因组DNA。取2 μL 得到的DNA 检测质量和浓度，样品符合要求后放于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计 基于荔枝基因组数据库，查找LcSAI基因上游2000bp的片段，设计上、下游引物，引物序列LcSAIpFw：5′TCTTCAACCTTGAACCATGACCT3′，LcSAIpRe：5′CCGGCAAGGGAGTGTAGTAT3′，引物委托广州艾基生物有限公司合成。

1.2.3 LcSAI 启动子克隆 以妃子笑DNA为模板，PCR 扩增LcSAI启动子序列。PCR 反应体系：2×PCR buffer 25 μL，dNTP（2 mmol/L）10 μL，上下游引物各2μL，DNA模板1μL，KOD 酶1μL，用ddH2O 补足50 μL。PCR反应程序：94 ℃ 2min，98 ℃ 10 s、68 ℃ 2.5 min、68 ℃7 min，35 个循环。经0.5%TBE 琼脂凝胶电泳，获得特异性目的条带，进行切胶回收，将回收产物连接至pEASY-T1 载体，转入大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞，于37 ℃培养箱过夜培养，随机挑取15 个单菌落进行菌落PCR 鉴定，挑取3 个阳性克隆菌液送至广州艾基生物技术有限公司测序。

1.2.4LcSAI启动子生物信息学分析 利用在线软件BDGP（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）预测LcSAI启动子转录起始位点及可能的核心启动子区域；启动子顺式作用元件利用在线分析工具PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测；启动子CpG 岛利用在线软件CpG Island Searcher（http://www.cpgislands.com）预测，预测时用1 个长度为200 bp 的窗口移过序列，每次移1 个碱基对，计算Y 值（实际值/期望值），CpG 岛定义为Y＞0.6 且GC 含量＞50%的200 bp 序列区域。

2 结果与分析

2.1 LcSAI 基因启动子的PCR 扩增

以妃子笑基因组DNA 为模板，LcSAIpFw、LcSAIpRe 为引物，扩增出长约1 000～2 000 bp 的单一条带，与预测目的条带大小吻合（图1）。将PCR 产物纯化回收后连接至pEASY-T1 载体，转入大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞，经培养后进行菌液PCR 鉴定（图2），阳性克隆菌液经测序，结果显示获得1 514 bpLcSAI基因启动子序列。

图1 LcSAI 基因启动子克隆结果Fig.1 Cloning of LcSAI gene promoter

图2 菌液PCR 检测结果Fig.2 PCR detection of bacterial liquid

2.2 LcSAI 基因启动子转录起始位点预测结果

利用在线软件BDGP 对LcSAI基因启动子的转录起始位点进行预测，LcSAI可能存在3 处核心启动子区域，分别位于276～326、458～508、1 183～1 233 bp，分值分别为0.94、0.82 和0.83，可能的转录起始位点分别为C、A、A（表1）。根据结果可推测位于276～326 bp 的序列很可能就是该基因真正的核心启动子区域，转录起始位点为位于第316 bp 的C。

表1 LcSAI 基因启动子核心启动子区域Table 1 Core promoter region of LcSAI gene promoter

2.3 LcSAI 基因启动子顺式作用元件预测结果

利用在线软件PlantCARE 对LcSAI基因启动子顺式作用元件进行预测，结果（图3）显示，LcSAI启动子序列除了存在大量的启动子核心元件如TATA-box 和增强元件CAAT-box 外，还存在多种特殊顺式元件，如光响应顺式元件、植物激素应答元件、MYB 结合位点、MYC 结合位点及一些未知功能元件。

图3 LcSAI 基因启动子序列及其关键元件Fig.3 Promoter sequence of LcSAI gene and its key elements

由表2可知，LcSAI启动子中含有35 个TATA-box 核心启动元件、38 个CAAT-box 增强元件，多种光响应元件和植物激素应答元件。光响应元件有5 种，分别为3-AF1 binding site、ATCT-motif、Box 4、G-box 和TCT-motif，其 中G-box 数量最多、有8 个，ATCT-motif 有4 个，Box 4 有2 个，3-AF1 binding site 和TCT-motif 各1 个。在植物激素响应元件中，LcSAI启动子含有茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif 和TGACGmotif 各2 个，赤霉素响应元件TATC-box 和水杨酸响应元件TCA-element 各1 个，脱落酸响应元件 ABRE 有5 个。

表2 LcSAI 启动子序列所含顺式作用元件Table 2 Cis-acting elements in LcSAI promoter sequence

2.4 LcSAI 基因启动子CpG 岛预测结果

CpG 岛作为表观调控的重要组成部分，在基因调控方面起重要作用。通过在线CpG 岛预测软件CpG Island Searcher 对LcSAI启动子序列进行CpG 岛预测。预测结果显示，在LcSAI基因启动子区没有符合限定条件的CpG 岛，这可能与获得的序列长度有关。

3 讨论

可溶性酸性转化酶定位在植物体液泡中，催化蔗糖水解为己糖，在植物生长发育过程中发挥重要作用。以积累己糖为主的葡萄果实中，在果实发育全过程中酸性转化酶活力均维持较高水平［17］。基因表达水平是由基因上游的启动子顺式作用元件及转录因子共同调控。启动子中包括多种顺式作用元件，如上游启动子元件、核心启动子元件、特殊启动子元件、远端上游元件等。其中在植物逆境胁迫诱导基因表达起关键作用为特殊启动子元件［18］。本研究通过克隆妃子笑酸性转化酶LcSAI启动子，采用生物信息学方法对LcSAI启动子的转录起始位点、顺式作用元件及CpG 岛进行在线预测，分析结果表明LcSAI启动子片段转录起始位点为在核心启动子区域第316 bp 的C。LcSAI启动子区没有预测到符合限定条件的CpG 岛，可能与获得序列长度不同有关。

对启动子结构和顺式元件的探索不仅有助于更好地调节单个或多个异源基因响应化学、生物以及环境因素刺激，而且为研究者改良作物提供了新思路，从而开启了设计启动子的新领域［19］。牛俊奇等［20］对甘蔗可溶性酸性转化酶基因及部分启动子进行克隆和序列分析发现，SoSAI1基因启动子在甘蔗生长发育和蔗糖积累并在应对环境胁迫中发挥作用。本研究表明，荔枝LcSAI启动子序列包含核心启动元件TATA-box 35 个和CAAT-box 38 个。其中核心启动元件TATA-box有介导基因转录的作用，普遍存在于真核生物启动子上，含有TATA-box 的基因对转录调控比较敏感［21］。核心启动元件CAAT-box 可增强启动子的强度，原因是因为CAAT-box 对转录起始的频率具有一定影响。此外，妃子笑LcSAI的启动子中还包含多种特殊启动子元件，如光响应元件（3-AF1 binding site、ATCT-motif、Box 4、G-box、TCT-motif）和植物激素响应元件（ABRE 脱落酸响应元件、CGTCA-motif、TGACG-motif 茉莉酸甲酯响应元件、TATC-box 赤霉素响应元件、TCAelement 水杨酸响应元件）。后续将对植物激素应答元件与转录因子结合调控LcSAI基因的表达进行深入研究。

4 结论

本研究以妃子笑荔枝为材料，克隆得到1 514 bpLcSAI启动子片段，LcSAI启动子片段转录起始位点可能存在3 处核心启动子区域。根据得分，位于276～326 bp 的序列很可能为LcSAI启动子真正的核心启动子区域，转录起始位点为位于第316 bp 的C。LcSAI基因的启动子序列包括35 个TATA-box、38 个CAAT-box 核心启动元件以及多种特殊启动子元件，如多种光响应元件和植物激素响应元件。LcSAI基因启动子共含有近30 种顺式作用元件，意味着LcSAI具有复杂的表达调控机制，顺式作用元件与相应的反式作用因子相互作用发挥生物学功能。