甲砜霉素与牛血清白蛋白相互作用的热力学研究

赵雪卿,王树照

(吕梁学院 化学化工系，山西 离石 033001)

血清白蛋白(Serum albumin，简称SA)是一种球状蛋白，它在生物体内血浆中占据主导地位，有着非常重要的作用[1].在生物体中，血清白蛋白可以通过运输胆色素、类固醇、氨基酸等物质达到运输的作用，也维持着血液正常的渗透压，在生命过程中有重要的意义[2].BSA具有水溶性，它与人血清白蛋白(HSA)结构同源性和相似的三维结构达到了76%，大多数的有机药物小分子能够和牛血清白蛋白结合，从而运输到靶组织器官中，故被频繁地选择为研究药物与SA相互作用的蛋白质模型[3].甲砜霉素(Thiamphenicol，简称Tap)，主要用于治疗由敏感菌引起的呼吸道、肠道等感染.Tap的毒性比氯霉素小，现已成为氯霉素的替代品，但也逐渐被发现其对人体会产生危害[4].本文通过研究不同温度下甲砜霉素与牛血清白蛋白的光谱行为，获得了其相互作用机制、作用力类型以及Tap对BSA构象的影响，这为开发新一代抗菌药物具有重要意义.

1 实验试剂和仪器

牛血清蛋白(BSA，上海金穗生物科技有限公司)5×10-4mol·L-1，用时稀释250倍即2×10-6mol·L-1；甲砜霉素(优级纯，大连科宝生物科技有限公司)2×10-3mol·L-1，用时稀释100倍即为2×10-5mol·L-1；pH为7.40的Tris-HCl缓冲溶液，实验所用水均为二次蒸馏水.

LS-45型荧光分光光度计(美国Perkin Elmer公司)，SYC-15B恒温槽(南京肯凡电子科技有限公司)，pHS-3C酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司).

2 实验方法

不同温度下，用移液枪准确吸取1.5 mL 2.0×10-6mol·L-1BSA溶液于比色皿中，固定激发波长为278 nm，依次向比色皿中滴加不同体积浓度为2.0×10-5mol·L-1Tap溶液，记录300～450 nm发射光谱.当激发波长范围介于240～320 nm时，分别扫描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步荧光光谱.

3 结果与讨论

3.1 荧光光谱

图1～3是不同温度下，随着甲砜霉素浓度的增加，BSA的荧光光谱.由图可知牛血清白蛋白的最大发射波长处于344 nm，随着甲砜霉素的体积逐渐增加，牛血清白蛋白的荧光强度呈现下降趋势，这说明甲砜霉素与BSA发生了相互作用，导致BSA的荧光猝灭.

图1 25℃下甲砜霉素对牛血清白蛋白的猝灭光谱图1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的浓度从1到12依次为：(0，0.03，0.98，1.59，2.25，2.56，2.86，3.15，3.43，3.95，4.39，4.94)×10-6mol·L-1

图2 35 ℃下甲砜霉素对牛血清白蛋白的荧光猝灭图谱1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的浓度从1到12依次为：(0，0.03，1.07，1.76，2.09，2.40，2.71，3.00，3.29，3.83，4.33，5.07)×10-6mol·L-1

图3 45 ℃下甲砜霉素对牛血清白蛋白的荧光猝灭图谱1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的浓度从1到9依次为：(0，0.03，0.20，1.07，1.71，2.25，2.81，3.43，4.08)×10-6mol·L-1

3.2 荧光猝灭类型判断

分子荧光猝灭主要分为动态猝灭和静态猝灭.其中，动态猝灭主要发生在猝灭剂与发光物质的激发态(Si)分子之间的相互作用，静态猝灭则主要发生在猝灭剂与发光物质的基态(S0)分子之间的相互作用[5-8].其中动态猝灭涉及到的是能量转移过程或电子转移过程，所以不会影响到血清白蛋白的构象.静态猝灭则会影响到BSA的构象及其生理活性[9].为了确定甲砜霉素Tap与牛血清白蛋白SA相互作用的猝灭类型，假定其为动态猝灭，可利用Stern-Volmer公式(公式1)计算动态猝灭常数.

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中Kq：双分子猝灭过程的速率常数；τ0：没有加甲砜霉素时测得的牛血清白蛋白的荧光寿命；[Q]为甲砜霉素的平衡浓度；F0为只有BSA溶液时的荧光强度；F为加入Tap溶液时的BSA的荧光强度；KSV叫做S-V猝灭常数.

根据Stern-Volmer方程作图可得：

由图4可得出下表：

图4 不同温度下甲砜霉素与BSA荧光猝灭的Stern-Volmer图

从表1中可以得出，25 ℃下Tap与BSA的猝灭常数为1.44×105L·mol-1，荧光分子的平均寿命τ0约等于10-8s，甲砜霉素对牛血清白蛋白的双分子猝灭常数Kq远大于2×1010L·mol-1·S-1[10]，故可以得出Tap对BSA是静态猝灭，改变温度后，Tap对BSA的猝灭方式仍为静态猝灭.在不同温度下比较S-V猝灭常数，可以看出随着温度的升高，其数值在不断的降低.出现该现象可能是由于温度的升高，BSA溶液的黏度降低；另一方面随着温度的升高，溶液中分子，热运动加快，以至于分子的扩散系数增大，从而引起络合物的稳定性降低，导致静态猝灭的程度减小.

表1 S-V方程相关系数

3.3 结合常数KA与结合位点数n的计算

通过表1分析可得出结论，无论在哪个温度下，甲砜霉素与牛血清白蛋白的荧光猝灭类型都是静态猝灭.故可用L-B方程求得甲砜霉素与牛血清白蛋白的结合位点以及结合常数.

L-B方程：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式中F0：未加甲砜霉素时牛血清白蛋白的荧光强度；F;加入甲砜霉素时的牛血清白蛋白的荧光强度；KA；Tap和BSA的结合常数；n：Tap和BSA的结合位点数.

改变温度条件，通过计算滴加甲砜霉素的浓度，记录滴加不同浓度时的荧光强度，即可通过L-B方程，拟合得图5，求得在25 ℃、35 ℃、45 ℃下的结合位点数n，结合常数KA.方程的斜率为n，截距为lgKA.

图5 不同温度下甲砜霉素与牛血清白蛋白的双对数图

由图5可以得到以下参数：

通过表2可以得出25 ℃、35 ℃、45 ℃的结合位点数分别为1.40、1.23、1.02；结合常数分别为1.41×107L·mol-1、2.09×106L·mol-1、1.78×105L·mol-1.二者的结合常数较大，由此可得出甲砜霉素与牛血清白蛋白之间结合作用较强，可以被蛋白质储存和运输.当温度升高时其结合常数降低，可能是由于随着温度的升高，甲砜霉素与牛血清白蛋白所形成的复合物稳定性降低，使得猝灭常数减小，这与静态猝灭的规律符合.结合位点n也随温度的升高而降低，说明在结合过程中温度的影响非常重要[11].因此，在甲砜霉素和牛血清白蛋白结合过程中，温度是一个很重要的因素.

表2 L-B方程相关参数

3.4 作用力类型的判断

有机药物小分子与蛋白质等大分子之间的作用力主要为范德华力、静电引力、氢键和疏水力等.以上相互作用力也可通过焓变、熵变等的大小和符号来判断.

其中的的ΔH和ΔS可利用范特霍夫方程求得：

(3)

式中KA为25 ℃、35 ℃、45 ℃下的结合常数；R为摩尔气体常数，单位为J/(mol·K).根据计算所得出的焓变ΔH和熵变ΔS，利用吉布斯-亥姆霍兹公式，即可求出Tap与BSA反应的ΔG：

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

依据图6中的斜率和截距可求得焓变ΔH和熵变ΔS(焓变和熵变的数值随温度的变化不大，因此可看为定值)再根据式(4)计算出不同温度下的ΔG.具体结果可见表3：

图6 甲砜霉素与牛血清白蛋白相互作用的范特霍夫方程

表3 不同温度下甲砜霉素与BSA相互作用的热力学参数

通过上表，可以发现体系的ΔH<0，ΔS<0，从而判断牛血清白蛋白与甲砜霉素之间的作用力为氢键和范德华力.ΔG<0，说明此反应为自发反应.

3.5 不同温度下甲砜霉素与BSA相互作用的构象分析

同步荧光所测得的Δλ=60 nm与Δλ=15 nm光谱分别表现为Trp和Tyr的特征荧光.其中，在同一浓度下，Trp特征荧光要比Tyr的特征荧光要强.并且它们两个的最大λem与它们所处环境的极性有关.

Δλ=60 nm时，此时表现出色氨酸的特征荧光，Δλ=15 nm时，此时表现出酪氨酸的特征荧光.图7到图12为不同温度下的同步荧图，表明在不同温度下Trp残基的荧光强度逐渐减弱，且最大λem向长波方向移动，发生了红移.说明随着甲砜霉素的不断滴入使得牛血清白蛋白中Trp残基微环境的极性增加，疏水性减弱.在不同温度下Tyr残基的荧光强度都逐渐减弱，最大激发波长向短波方向移动，发生了蓝移.该现象表明随着甲砜霉素的不断滴入使得BSA中Tyr残基微环境的极性减少，疏水性增强.

图7 25 ℃下Δλ=60 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图8 25 ℃下Δλ=15 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图9 35 ℃下Δλ=60 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图10 35 ℃下Δλ=15 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图11 45 ℃下Δλ=60nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图12 45 ℃下Δλ=15 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

4 结论

不同温度下，甲砜霉素与牛血清白蛋白的作用机制均为静态猝灭，并随着温度的升高，甲砜霉素与牛血清白蛋白的相互作用的结合位点数逐渐降低，结合常数降低，二者结合的作用力为氢键与范德华力，同步荧光表明甲砜霉素对牛血清白蛋白的构像有影响.