荔枝玫瑰酒延缓小鼠皮肤衰老的研究

徐 莹， 李晓娟， 孟 君， 张 凯， 唐 雪*

（1. 江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2. 株洲千金药业股份有限公司，湖南 株洲 412000）

皮肤受环境、年龄、生活方式等影响，往往容易引起结构、功能和外观的变化，例如皱纹的增加、皮肤松弛、干燥粗糙等衰老特征。 皮肤衰老是一个高度复杂且尚未完全了解的过程，自由基衰老学说指出衰老是由各种氧自由基（ROS）在体内过度积累，过剩的活性氧自由基会导致大分子物质氧化损伤并加速其进程，导致细胞功能受损，进而导致机体衰老[1-2]。 因此，降低ROS 生成和增强抗氧化能力可在一定程度上缓解皮肤衰老进程。

荔枝在我国培植历史悠久，主要分布于我国东南和西南部地区。 《本草纲目》中认为荔枝果肉具有益智、健气的功效。 成熟荔枝的果皮呈暗红色至鲜红色，果肉莹白剔透、状若凝脂、清甜浓香、营养丰富，深受广大消费者喜爱。 荔枝作为一种药食同源的果品，其果肉营养成分丰富，富含多糖、酚类等活性物质，具有较强的抗氧化、降血脂等作用[3-5]。 玫瑰是集药食同源和美化环境为一身的木本植物，花瓣富含维生素C、氨基酸等物质，具有降血糖、抗氧抗炎等生物活性[6]。 此外，玫瑰富含萜类物质，不仅能保持皮肤湿润，还能深层养护肌肤[7]。

随着人民生活水平的提高，倾向于以绿色健康的饮食方式来延缓衰老，对自然来源的抗皮肤衰老产品的需求也日益迫切。 开发一款改善皮肤健康的果酒，不但具有很大的市场潜力，而且也能提升产品竞争力。 荔枝和玫瑰自古以来美肤养颜的功效就深入人心，且经大量研究表明，荔枝和玫瑰不仅富含多种营养成分，而且含有大量的多酚类、黄酮类化合物，具有一定的健康功效。 目前，荔枝和玫瑰的销售方式以鲜销和提炼精油为主，尽管已有一些发酵型荔枝果酒或玫瑰酒类出现在国内市场上，但是这些产品具有营养健康功效单一、口感色泽欠佳的缺点。 为了克服上述问题，综合荔枝和玫瑰的营养保健价值，作者所在课题组前期以新鲜荔枝、玫瑰花（重瓣玫瑰花）为主要原料，配以果葡糖浆，依据传统中药君臣佐使配方，酿制得到了一款香气纯正和谐、口感纯净爽怡的荔枝玫瑰酒。 然而，荔枝玫瑰酒是否保留了荔枝、玫瑰原有的营养物质和活性成分，长期饮用是否对皮肤具有营养健康功效，还需进一步研究。 因此，作者利用D-半乳糖诱导的小鼠衰老模型对荔枝玫瑰酒可能的功效进行探究，以期为产品的进一步开发和品控提供有价值的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料 荔枝玫瑰酒（体积分数12%）：株洲千金药业股份有限公司产品。

1.1.2 主要试剂 D-半乳糖、 辣根过氧化物酶、多聚甲醛：国药集团提供；过氧化氢酶（CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、羟脯胺酸（HYP）试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）测试盒：南京建成生物研究所提供；总蛋白质定量（BCA）试剂盒： 碧云天生物技术研究所提供；Oligo（dT）、dNTP、M-MLV 逆转录酶、RNase Inhibitor：美国赛默飞生物科技有限公司产品。 Trizol、SYBR Green Master Mix：南京诺维赞生物科技有限公司产品；肿瘤坏死因子（TNF-α）ELISA 试剂盒、白细胞介素（IL-1、IL-6、IL-10）ELISA 试剂盒：江苏酶免实业有限公司产品；H&E 染色试剂盒、Masson 染色试剂盒：北京索莱宝科技有限公司产品。 所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

R686VLT 型超低温冰箱：美国INVETRO 公司产品；5804R 台式高速冷冻离心机：美国Thermo Scientific 公司产品；手动轮转切片机：美国徕卡公司产品；倒置相差显微镜：日本Olympus 公司产品；7900HT Fast Real-Time PCR 仪：美国ABI 公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 动物与分组 动物试验经江南大学动物营养研究所动物保健与使用委员会批准，根据《中国动物福利和实验指南》，按照规定执行。60 只5 周龄体质量（29.66±1.21） g 的ICR 雄性小鼠饲喂于江南大学实验动物中心。保持环境相对温度为（23±2） ℃和相对湿度为（60±5）%条件下，光照/黑暗周期为12 h/12 h（光照时间为08：00—20：00），所有小鼠均自由采食与进水，每周称量并记录体质量和饮水量。

参考文献[8]实验方法，除正常组外，剩下5 组注射1200 mg/（kg·d）D-半乳糖造模。 同时，荔枝玫瑰酒组分别饲喂10、20、40 mL/kg （以体质量计）荔枝玫瑰酒（根据文献[9]研究表明60 kg 成人每日果酒推荐饮用量300 mL，上述荔枝玫瑰酒添加量相当于60 kg 成人每天分别摄入75、150、300 mL 产品），VC 对照组饲喂450 mg/kg（以体质量计）维生素C。所有动物自由采食饮水，6 周后进行样本采集分析。

1.3.2 样本采集 饲养结束后， 进行小鼠背部脱毛。 眼球采血后，取小鼠颈背部皮肤、肝脏、肾脏、肌肉，称质量。 血液放置15 min 后，3500 r/min 离心10 min 分离血清，放置于-80 ℃冰箱待测。 皮肤、肝脏、肾脏、肌肉取同一部位0.1 g，加入0.9 mL 生理盐水后匀浆，4000 r/min 离心10 min 后分离上清液，按照说明书进行BCA 蛋白质定量后放置于-80℃冰箱待测。

1.3.3 氧化应激指标测定 活性氧自由基测定采用化学发光法[10]。T-AOC 能力、MDA 质量摩尔浓度、SOD 活性、CAT 活性、GSH-Px 活性用相应的试剂盒进行测定。

1.3.4 皮肤理化指标测定 皮肤含水率（水分质量分数）测定：参考文献[8]实验方法进行。 皮肤羟脯胺酸（HYP）质量分数严格按照试剂盒说明书测定。

1.3.5 血浆炎症因子的测定 血浆中的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 均严格按照ELISA 试剂盒说明书测定。

1.3.6 总RNA 提取和实时荧光定量PCR 分析 采用Trizol 法提取皮肤总RNA， 测定RNA 的纯度和浓度， 严格按照逆转录酶试剂盒（MultiScribe Reverse Transcriptase；Applied Biosystems）说明书进行操作，将RNA 逆转录成cDNA。 将cDNA、引物和SYBR Green Master Mix 混合均匀，使用实时荧光定量PCR 扩增并检测荧光强度，扩增程序如下：95 ℃5 min，循环1 次；95 ℃20 s；60 ℃30 s、72 ℃20 s，循环45 次；72 ℃终末延伸2 min。以β-actin 作为参照基因，采用2-ΔΔCt计算基因相对表达量。 引物序列见表1。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 Primers used in RT-PCR

1.3.7 组织切片 解剖小鼠后，取小鼠颈背部皮肤约1 cm×1 cm 方格于体积分数4%多聚甲醛固定液中。 24 h 后取出组织，按照体积分数50%～100%乙醇的梯度脱水，每级30 min。 放入正丁醇中进行透明，每级20 min。浸蜡6 h。将干净的石蜡在60 ℃水浴反复溶解3 次后倒入石蜡包埋机，将组织包埋在组织包埋盒中，冷却后切片，厚度为5 μm。 70 ℃烤片30 min，取出后脱蜡。

H&E 染色： 切片严格按照H&E 染色试剂盒说明书操作。

Masson 染色： 切片严格按照Masson 染色试剂盒说明书进行水化、初染、盐酸分化、复染、脱水、透明等步骤进行操作，树脂封片后镜检。

1.4 数据处理

结果用平均值±标准差（Mean±SD）表示。 采用SPSS 17.0 软件对数据进行单因素（ANOVA）方差分析。各组间字母不同表示差异显著（P＜0.05），字母相同表示无显著差异。 然后进行Tukey 多重比较检验。GraphPad Prism 7.01 软件处理作图。体外实验各指标均进行3 次独立重复测定。

2 结果与讨论

2.1 荔枝玫瑰酒对D-半乳糖诱导老化损伤小鼠体质量、饮水量的影响

由表2 可知，小鼠饲喂6 周后，各组终体质量、饮水量均无显著性差异（P＞0.05），说明饲喂荔枝玫瑰酒对衰老小鼠体质量及饮水量无显著影响。

表2 荔枝玫瑰酒对小鼠体质量、饮水量的影响Table 2 Effect of lychee rose wine on body weight and water intake of mice

2.2 荔枝玫瑰酒对D-半乳糖诱导老化损伤小鼠皮肤理化指标的影响

健康皮肤的锁水能力较强，而衰老皮肤的锁水能力降低，导致皮肤干燥粗糙，缺乏光泽。 皮肤的结缔组织主要由胶原蛋白和弹性蛋白组成。 胶原蛋白占皮肤干质量的70%～80%， 并赋予真皮机械和结构完整性。 羟脯氨酸（HYP）仅存在于胶原蛋白中，常用其质量来评价组织胶原蛋白的总量[11]。 如图1所示，D-半乳糖导致小鼠皮肤含水率（质量分数）、羟脯胺酸和胶原蛋白质量分数 （以皮肤湿质量计）显著降低（P＜0.05），这可能是D-半乳糖引起皮肤氧化损伤，胶原纤维合成能力下降，胶原蛋白流失，纤维之间空间间隙减少、拉伸异常，导致皮肤萎缩，粗糙度、干燥度增加[11]。 与之相反，饲喂高剂量荔枝玫瑰酒可显著提高含水率、羟脯胺酸和胶原蛋白质量分数（P＜0.05），表明适宜剂量的荔枝玫瑰酒可适当改善衰老小鼠皮肤性能。

图1 荔枝玫瑰酒对小鼠皮肤理化指标的影响Fig. 1 Effect of lychee rose wine on physical and chemical indicators of mice skin

2.3 荔枝玫瑰酒对D-半乳糖诱导老化损伤小鼠皮肤组织形态的影响

皮肤H&E 染色可见，D-半乳糖注射使小鼠皮肤组织形态发生改变，真皮层厚度明显减少，皮肤萎缩（见图2）；Masson 染色中胶原纤维呈蓝色，通过比较分析发现D-半乳糖诱导皮肤真皮层胶原纤维含量、胶原束空间密度显著降低（见图3）。 与之相反， 高剂量荔枝玫瑰酒饲喂可增加真皮层厚度、胶原纤维含量及胶原束空间密度， 其效果与VC 相当（见图2（c）和（d）和图3（c）和（d）），表明一定剂量的荔枝玫瑰酒具有改善皮肤老化状态的功效。

图2 小鼠皮肤切片H&E 染色图（×200）Fig. 2 Mice skin pad slice with H&E staining（×200）

图3 小鼠皮肤切片Masson 染色图（×200）Fig. 3 Mice skin pad slice with Masson staining（×200）

2.4 荔枝玫瑰酒对D-半乳糖诱导老化损伤小鼠皮肤氧化还原稳态和血浆炎症因子质量浓度的影响

老化过程中皮肤抗氧化活性的降低是一个至关重要的因素，导致皮肤发生氧化应激、累积的过剩ROS 极易攻击生物大分子，进而造成RNA 断裂、脂质过氧化等。 机体处于正常状态下，自由基与抗氧化系统处于微妙平衡中， 在SOD、GSH-Px、CAT等酶类物质以及维生素C 等非酶类抗氧化物质的共同参与下，ROS 处于浓度中等， 但当机体不足以清除过剩ROS 时， 便会引起细胞信号通路异常，促发氧化应激，从而使得脂质过氧化产物（MDA）大量产生，导致皮肤衰老[12-13]。 如表3～4 所示，与正常组相较， 向小鼠连续注射D-半乳糖会引起皮肤ROS和MDA 水平（质量摩尔浓度）显著提高，抗氧化酶（GSH-Px、SOD、CAT）活性和T-AOC 能力降低（P＜0.05），促发氧化应激。 而饲喂高剂量荔枝玫瑰酒可在一定程度上恢复上述指标（P＜0.05），改善衰老小鼠皮肤氧化还原稳态。

表3 皮肤氧化还原指标Table 3 Redox index in skin

此外，炎症因子（TNF-α、白细胞介素等）的浸染会生成大量ROS，进一步加剧氧化损伤，通过激活NF-κB，使MMPs 表达增多，降解胶原蛋白，导致胶原蛋白流失，皮肤衰老加剧[14-15]。 大量研究表明，多酚、黄酮类物质不仅具有抗氧化、猝灭自由基的能力，而且可以通过调节细胞信号通路，抑制炎症因子生成，有研究者指出，绿茶多酚能减少肠道IL-6和IL-8 的释放，从而对肠道具有一定的保护作用[16]。Wan 等指出荔枝、玫瑰中富含多酚、黄酮类物质并具有较好的抗氧化抗炎能力[17]。由表5 可知，饲喂高剂量荔枝玫瑰酒可在一定程度上抑制炎症因子（TNF-α、IL-1、IL-6）的分泌，促进抗炎因子（IL-10）的生成（P＜0.05），这可能与其含有丰富的多酚、黄酮类等植物活性成分有关， 能有效地减少炎症反应，进而延缓皮肤衰老进程。

表5 血浆炎症因子质量浓度Table 5 Inflammatory factor content in plasma

表4 皮肤抗氧化酶活性Table 4 Antioxidase activity in skin

2.5 荔枝玫瑰酒对小鼠皮肤胶原蛋白代谢相关基因表达水平的影响

TGF-β1 是细胞生长分化的调控者， 主要负责促进胶原蛋白前体基因（COl1a1、COl3a1）的合成[18]。与之相反，MMPs 是一类降解胶原蛋白的内肽酶，其中MMP-1 和MMP-8 主要催化Ⅲ型和Ⅰ型胶原蛋白降解[19]。研究发现，炎症因子浸染会激活核因子激活的B 细胞的κ-轻链增强子（NF-κB），使MMPs 表达增多，加剧分解胶原蛋白，导致胶原蛋白减少。 转录因子AP-1 可以调节TGF-β1 和几种MMPs 的转录，AP-1 活化，抑制了TGF-β 的表达，上调了MMPs的表达，使胶原蛋白分泌减少，胶原分解增加[20]。

如图4～5 所示，与正常组相比，D-半乳糖处理导致小鼠皮肤TGF-β1 mRNA 表达水平显著下调，NF-κB、AP-1、MMP-1 及MMP-8 mRNA 的表达显著上调（P＜0.05），这可能是导致衰老小鼠皮肤胶原蛋白含量减少、含水率降低的主要原因之一。 而饲喂高剂量的荔枝玫瑰酒能显著上调TGF-β1 和COl1a1 mRNA 的表达， 抑制NF-κB、AP-1、MMP-1及MMP-8 mRNA 的表达水平（P＜0.05）。 结果表明，荔枝玫瑰酒改善衰老皮肤状态可能与提高皮肤胶原纤维合成与抑制胶原纤维分解相关基因的表达水平有关。

图4 皮肤胶原合成基因mRNA 表达水平Fig. 4 mRNA expression level of collagen synthesis gene in skin

图5 皮肤胶原分解基因mRNA 表达水平Fig. 5 mRNA expression level of collagen decomposition gene in skin

2.6 荔枝玫瑰酒对小鼠皮肤抗氧化相关基因表达水平的影响

Nrf2/GSK-3β 是细胞内重要的抗氧化信号通路，对胶原蛋白代谢意义重大[21]。 正常条件下，活化的核因子-E2 相关因子2（Nrf2）被Kelch 样ECH 相关蛋白1（Keap1）抑制[22]。 当ROS 等应激物增加时，促进Keap1 半胱氨酸残基氧化，诱导Nrf2 释放与活化， 介导Nrf2 易位至细胞核与抗氧化反应元件结合， 启动多种抗氧化酶表达， 如血红素加氧酶1（HO-1）、NADPH 醌氧化还原酶（NQO1）等[23]。GSK-3β 是一种糖原合成激酶，介导Nrf2 磷酸化，使其被降解，抑制抗氧化信号通路[24]。

与正常组相比，D-半乳糖皮下注射显著下调了衰老小鼠皮肤Nrf2、HO-1 及NQO1 mRNA 相对表达水平（P＜0.05），上调GSK-3β 相对表达水平（P＜0.05）（见图6），这表明皮肤抗氧化通路被抑制。 与之相反，饲喂中、高剂量荔枝玫瑰酒可部分恢复上述基因表达水平，且高剂量效果最好，表明荔枝玫瑰酒的抗氧化保护作用可能与调节抗氧化通路关键因子的基因表达水平有关。

图6 皮肤抗氧化相关基因mRNA 表达水平Fig. 6 mRNA expression level of antioxidant related gene in skin

2.7 讨论

皮肤作为机体的第一道屏障，发生衰老的概率与其他组织相比较高[24]。自由基衰老学说认为，当皮肤长期受到紫外线照射、不良生活习惯（如吸烟以及高能量膳食模式等）作用下，自由基大量生成，超出机体所能清除速度时，会造成自由基和抗氧化系统失衡。 一方面，过剩的自由基参与细胞内反应，氧化损伤生物膜， 导致皮肤干燥松弛和重要性能丧失，加剧皮肤衰老[25-27]。 另一方面，炎症因子浸染，通过激活NF-κB，使MMPs mRNA 表达增多，降解胶原纤维等，羟脯氨酸生成减少，胶原蛋白断裂紊乱，最终使皮肤硬化衰老[24]。

作者通过构造小鼠衰老模型，初步探讨了荔枝玫瑰酒对衰老皮肤的干预作用。 结果表明，饲喂高剂量荔枝玫瑰酒6 周可部分恢复D-半乳糖诱导的小鼠皮肤含水率（水分质量分数）、羟脯胺酸、胶原蛋白质量分数（P＜0.05），支撑皮肤真皮层并且抑制其萎缩、 改善胶原纤维含量及胶原束空间密度，降低皮肤ROS、MDA 和炎性因子含量（P＜0.05），显著提高抗氧化能力。 可见，适宜剂量的荔枝玫瑰酒具有提高衰老小鼠皮肤抗氧化能力、抑制氧化应激和炎症反应、缓解皮肤衰老的作用。

许多植物活性成分具有调节机体功能、延缓衰老的作用，如多酚、黄酮类物质等。 已有研究表明，姜黄素可增加Nrf2 介导的NQO1 表达水平[25]；有研究者指出荔枝、玫瑰中富含多酚、黄酮类物质并具有较好的抗氧化抗炎能力[26-27]。 作者所在实验室前期结果显示，荔枝玫瑰酒较好地保留了荔枝和玫瑰的植物活性成分，其中多酚、黄酮以及单宁等活性成分，分别达到254.32、430.00、123.25 μg/mL，其中多酚含量显著高于市售的樱桃酒和桑椹红酒，与赤霞珠葡萄酒含量相近[28-31]。 同时，体外抗氧化研究显示，荔枝玫瑰酒对自由基的清除能力显著高于荔枝酒、玫瑰酒、葡萄酒和蓝莓酒。 植物多酚和黄酮类物质一方面具有良好的抗氧化功能，能够直接清除机体内自由基，另一方面可通过与细胞炎症信号分子结合，激活抗氧化信号蛋白通路，减少炎性因子的浸染及氧化反应导致的皮肤老化[32]。 Sarin 等指出在肝损伤小鼠的肝脏细胞中，荔枝中的酚类物质可增加其抗氧化酶活性，减少线粒体ROS 生成，发挥抗氧化功效[31]。 薛丽香等指出，绿茶中EGCG 能降低UVB 诱发的皮肤炎症， 减少皮肤氧自由基产生，具有保护皮肤的作用[30]。高爱莉等报道，在无毛鼠的光老化实验中，茶多酚可上调Nrf2 蛋白通路，增加抗氧化酶表达，起到一定的保护皮肤正常生理功能的功效[29]。 因此，综合上述研究结果推测，荔枝玫瑰酒延缓小鼠皮肤衰老的功效与其含有丰富的植物活性成分密切相关。

3 结语

作者研究了一款荔枝玫瑰酒延缓小鼠皮肤衰老的作用。 结果显示饲喂高剂量荔枝玫瑰酒可部分改善衰老小鼠皮肤理化性能，增加真皮层厚度和胶原纤维含量，强化衰老小鼠皮肤抗氧化能力；同时通过上调抗氧化基因Nrf2、HO-1、NQO1 和皮肤胶原蛋白合成基因TGF-β1 mRNA 表达水平及恢复分解相关基因MMP-1 及MMP-8 mRNA 表达水平，增强胶原蛋白合成能力。 荔枝玫瑰酒延缓皮肤衰老的功效可能与其含有丰富的植物活性成分密切相关。