荧光定量聚合酶链反应联合抗酸染色在肾结核组织病理诊断中的应用

范正超，尹航，刘建震，朱晓黎，李崇斌

临床肺外结核病占结核病的10%，泌尿生殖系结核占肺外结核病的30%～40%，尤以肾结核最为多见，是仅次于淋巴结核病的第二大肺外结核病，结核病发病率和死亡率均居我国传染病之首［1-2］。病理学诊断是确诊肾结核的重要手段，主要采用组织学苏木素-伊红（HE）染色及抗酸染色进行诊断。但由于组织学改变（肉芽肿性炎症）有时不典型，有些其他细菌感染性病变如非结核分枝杆菌感染、真菌感染等亦可引起类似病理变化，鉴别诊断困难［3-4］，因此结核病的病原学诊断一直为人们所关注，其是感染性疾病的最终确诊手段。结核病原学诊断有抗酸染色、结核杆菌培养、结核杆菌核酸基因检测等。抗酸染色诊断结核病的灵敏度低，且不能有效区分非结核分枝杆菌、麻风杆菌、诺卡菌属、军团菌属等抗酸染色阳性菌［5-6］；结核杆菌培养虽然诊断准确性高，但存在培养周期长、延误药物治疗等问题［7］。近年来基因检测技术发展迅速，为上述问题的解决提供了新的思路，如实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术在尿标本中可以检测微量结核分枝杆菌特异基因序列，可为肾结核诊断提供更敏感、快速的依据［8］，但目前两种方法的比较国内报道仅见于痰涂片，两项技术应用在肾组织标本中的研究较少。故本研究应用实时荧光定量PCR 检测技术在肾结核组织切片中检测结核分枝杆菌特异基因序列，并与抗酸染色检测技术进行对比，评估荧光定量PCR 技术联合抗酸染色技术在肾结核病理诊断中的应用价值，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2013 年6 月至2019 年6 月河北省胸科医院泌尿外科手术切除、病理科保存的肾病石蜡包埋标本65 例，以病理诊断结果为分类标准，将术后明确诊断为肾结核的30 例纳入阳性组（肾结核病组），其中男12 例，女18 例；病变位于左侧14 例，右侧16 例；年龄范围为30～65 岁，年龄中位数为50.5（40.5，59.25）岁。术前均诊断为活动性无功能肾结核（患侧），行后腹腔镜或开放手术肾切除术，术后病理诊断均为肾结核。将同一时段因肾外伤、肾肿瘤等行肾切除术或保留肾单位部分切除术的35例纳入阴性组（非结核病组），其中肾透明细胞癌15 例，肾盂癌7 例，无功能性肾结石6 例，肾乳头状细胞癌、创伤性肾碎裂伤、无功能性肾积水各2例，囊性肾癌1 例，其中男16 例，女19 例；病变位于左侧15 例，右侧20 例；年龄范围为30～70 岁，年龄中位数为50（40，60）岁。术后病理均诊断为非结核病。两组性别、肾脏患侧、年龄等一般资料比较，均差异无统计学意义（P＞0.05），均有可比性。病人或近亲属对研究方案签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

肾结核病纳入标准：根据《中国结核病病理学诊断专家共识》［9］结核病病理诊断标准：①慢性肉芽肿伴坏死病变中找到经典结核结节；②慢性肉芽肿伴坏死组织中査到抗酸杆菌；③慢性肉芽肿伴坏死病变中未见经典结核结节或抗酸杆菌，但临床细菌学或影像学检查支持结核诊断，并且抗结核治疗有效；以上三条具备其中一条即可。

1.2 仪器与方法

1.2.1 试剂及仪器抗酸染色试剂盒购自南京一基生化科技有限公司；石蜡包埋组织DNA 提取试剂盒、结核分枝杆菌核酸测定试剂盒均购自成都博奥晶芯生物科技有限公司。荧光定量PCR 仪，型号ABI 7500，为我院分子实验室提供。

1.2.2 抗酸染色检测石蜡组织标本切片厚4µm，常规二甲苯脱蜡并水洗。具体染色方法略，参见碱性复红法（Ziehl-Neelsen）染色法［10］。结果判定：抗酸菌呈红色杆状，其他组织细胞或细菌呈蓝色。

1.2.3 DNA 提取及PCR 扩增检测 （1）所有石蜡组织标本连续切片5µm×10 张，置于消毒好的1.5 mL离心管中。（2）按照DNA 提取试剂说明书操作步骤提取组织标本DNA。（3）DNA 扩增：按照结核分枝杆菌核酸测定试剂盒说明书要求进行。PCR 反应条件：92 ℃1 min→60 ℃1 min→72 ℃1 min，30 个循环。在72 ℃进行荧光检测。每批检测标本均设置内标阳性对照。检验结果判定：Ct＜40 且扩增曲线呈典型S型为阳性，Ct≥40或无扩增曲线为阴性。

1.3 统计学方法利用SPSS 17.0 统计软件进行数据处理，定量数据不满足正态分布者采用两组样本比较的秩和检验（Mann-Whitney U），定性数据采用两组样本比较的χ2检验，不满足χ2检验条件时选择确切概率法，以α＝0.05为检验水准。

2 结果

2.1 荧光定量PCR 检测及抗酸染色的检测结果

本研究荧光定量PCR 检测结核分枝杆菌内标阳性对照曲线呈S形且Ct值＜40，结核分枝杆菌特异基因扩增曲线呈典型S 型且Ct＜40 者为阳性，否则为阴性。抗酸染色检测中呈亮红色杆状、略弯曲、串珠状成堆或散在分布者为结核分枝杆菌（图1A），阴性为浅蓝色背景下不能检出亮红色杆菌（图1B）。

2.2 荧光定量PCR 检测与抗酸染色检测的结果

本研究肾结核病组中抗酸染色阳性16例，假阴性14例，灵敏度53.3%；非结核病组中假阳性2 例，其中肾盂癌、无功能性肾积水各1例，进一步复查抗酸染色肾盂癌1例阴性，无功能性肾积水者仍为阳性，再进一步行结核分枝杆菌PCR 基因检测为阴性，考虑为肾积水合并NTM 感染，余33 例均阴性，特异度为94.3%。荧光定量PCR 检测肾结核病组中阳性25例，假阴性5 例，灵敏度为83.3%；非结核病组中假阳性1例，为患有肾透明细胞癌者，再进一步行PCR检测复查结果转为阴性，考虑为标本污染。非结核病组中阴性34 例，特异度为97.1%。荧光定量PCR检测的灵敏度较抗酸染色检测的灵敏度高，两者差异有统计学意义（χ2=6.24，P=0.012）。荧光定量PCR 检测的特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于抗酸染色检测的结果，但两者比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。荧光定量PCR 检测的准确性高于抗酸染色检测的准确性，两者比较差异有统计学意义（χ2=5.47，P=0.019），见表1，2。

表1 纳入荧光定量聚合酶链反应与抗酸染色检测结果/例

2.3 荧光定量PCR 联合抗酸染色在肾组织结核分枝杆菌检测的结果本研究抗酸染色与荧光定量PCR 联合诊断肾结核，其中肾结核病组中阳性29例，假阴性1 例，灵敏度为96.7%；非结核病组中假阳性2 例，阴性33 例，特异度为94.3%。抗酸染色和荧光定量PCR 的灵敏度、阴性预测值、准确性均明显高于抗酸染色、荧光定量PCR 单独检测值，差异有统计学意义（P＜0.05），联合检测的特异度、阳性预测值低于荧光定量PCR 单独检测值，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表3，4。

表2 荧光定量聚合酶链反应与抗酸染色检测肾结核病原体的准确度比较/%

表3 纳入荧光定量聚合酶链反应和抗酸染色联合检测的结果/例

3 讨论

PCR 技术是一项革命性的分子生物学技术，该技术由Mullis 于1983 年发明，用于体外扩增特定DNA 片段，很快发展成生命科学研究不可或缺的手段。1989 年Hance 等将PCR 技术用于检测临床标本中的结核杆菌，为结核感染的病原学诊断提供了新的途径。荧光定量PCR 技术进一步实现了从定性到定量的飞跃，具有特异度高、灵敏度高、定量准确、简单易行等优点［11-14］。

结核分枝杆菌是人类结核病的病原菌，因此常将寻找病原菌作为结核疾病诊断的金标准。对于肾结核，尿结核杆菌培养最有诊断价值，但灵敏度变化较大（10.7%～90%），且存在培养周期长、延误治疗等问题；尿沉渣抗酸染色检测存在灵敏度低（42.1%～52.1%），易污染，不能有效排除其他抗酸染色阳性菌干扰（如包皮垢分枝杆菌）等问题［15-16］。尿结核分枝杆菌DNA 检测对结核杆菌具有较高的灵敏度。国外有研究报道以尿结核分枝杆菌培养阳性为金标准，PCR 检测尿结核分枝杆菌的灵敏度达95.6%，特异度达98.1%，而国内有研究报道的灵敏度为80%，特异度为78.5%［17-18］。因尿标本中存在某些扩增抑制药物或标本易被污染等问题，使得该检查易出现假阴性或假阳性结果。因此尿结核分枝杆菌DNA 检测结果必须结合培养、影像学或活检标本的组织学检查结果方能确立诊断。

表4 抗酸染色、荧光定量PCR及抗酸染色和荧光定量PCR对肾结核病原体检测准确度的比较/%

相对在肾结核病人尿液标本的结核分枝杆菌病原菌检测研究报道，我们在本研究中采用对肾结核组织标本病原菌检测灵敏度较高的荧光定量PCR 和抗酸染色技术，以临床确诊的无功能肾结核的肾脏切除标本（病理诊断为结核病）为阳性对照，以非肾结核病变的肾脏切除标本（病理诊断排除结核病）为阴性对照，分别研究、比较两种检测方法单独应用的检测准确度和两个指标联合应用平行检测在肾结核病理诊断中的应用价值。

在本研究中我们发现：（1）荧光定量PCR 技术在肾结核确诊病例组织切片中检测的灵敏性为83.3%，与文献报道的在尿沉渣液体标本中检测的灵敏度80.0%～95.6%有一定差距，提示荧光定量PCR 检测灵敏度在不同介质标本（液体、固体组织）中有差别，临床应用中应注意相关区别。考虑可能原因如下：①与结核病病灶是否处于活动期有关，尿标本荧光定量PCR 检测多用于临床诊断，大多数病例结核病处于活动期，细菌量大，而本研究中手术切除的肾结核均已行充分抗结核治疗，病灶组织中的细菌量大幅度降低，导致阳性率下降；②石蜡组织标本经固定、脱水等处理过程影响，结核杆菌DNA 的检出率降低，这需要进一步的实验论证。（2）肾组织荧光定量PCR 检测的灵敏性较抗酸染色检测的灵敏度提高30.0%，差异有统计学意义。肾组织荧光定量PCR 检测的准确率也明显高于抗酸染色的检测结果，差异有统计学意义，充分提示在肾结核病理诊断中，荧光定量PCR 技术较抗酸染色技术在病原学检测方面具有更大的应用价值。（3）在本研究中，我们进一步探索了抗酸染色联合荧光定量PCR 检测在肾结核组织标本中检测的准确度，我们发现两种指标联合检测的灵敏性、阴性预测值、准确性均明显高于单独任何一种检测的指标值，充分提示抗酸染色检测联合荧光定量PCR 检测在肾结核病理诊断中拥有更好的检测准确度。在本研究阴性组（非结核病组）中荧光定量PCR 检测假阳性1 例，经复测转为阴性，提示与在石蜡标本处理、DNA 提取过程中标本间污染有关，需进一步加强实验室的清洁、消毒工作，提高检测过程的质量控制标准。非结核病组中抗酸染色检测假阳性2 例，肾盂癌1 例，无功能性肾积水1 例，进一步复查抗酸染色肾盂癌1 例转为阴性，考虑与标本之间污染有关外；无功能性肾积水者仍为阳性，再进一步行结核分枝杆菌PCR 基因检测转为阴性，考虑为肾积水合并NTM 感染，再次提示抗酸染色检测不能有效区分非结核分枝杆菌（如包皮垢分枝杆菌）、诺卡菌属、军团菌属等抗酸染色阳性菌感染，抗酸染色阳性者可进一步行荧光定量PCR 检测或结核杆菌培养区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，提高检测的特异度。

本研究阳性组（肾结核病组）中组织荧光定量PCR 检测阳性25 例，其中12 例抗酸染色阳性，13 例抗酸染色阴性，分析可能原因：抗酸染色检测的灵敏度低于荧光定量PCR 的检测结果，在行充分抗痨治疗后组织标本结核菌量水平明显降低的情况下，抗酸染色的灵敏度会进一步降低，假阴性率升高。肾结核组中抗酸染色检测阳性16例，其中例荧光定量PCR 检测阳性12 例，4 例阴性，考虑可能原因：抗酸染色阳性标本中存在扩增反应抑制物，抑制PCR扩张，导致荧光定量PCR 检测出现假阴性。笔者查阅最近文献，以抗酸染色联合荧光定量PCR 技术检测肾结核组织标本用于病理诊断的研究报道较少，两种方法联合检测文献亦较少，且以荧光定量PCR联合痰涂片抗酸染色为主。本文研究结果提示荧光定量PCR 检测联合抗酸染色检测可提高肾结核组织标本病原体检测的灵敏性、阴性预测值和准确性，在肾结核的病理诊断中具有良好的应用价值。

但本研究有一定的局限性，首先本研究为单中心、小样本研究，研究结果缺乏广泛的代表性，需进一步扩大研究中心、增加样本量；其次，本研究未行组织标本的结核分枝杆菌培养，检测方法指标的比较缺乏一定的说服力，需在下一步研究中改进。

（本文图1见插图5-2）