宫颈鳞癌组织中泛素偶联酶E2、食管癌相关基因4表达情况与预后的关系

饶云霞，陈新生

宫颈鳞癌约占所有宫颈癌70%以上，其在50～55 岁人群中发病率较高，且有年轻化趋势［1］。由于临床筛查和治疗水平提高，近年来宫颈鳞癌早期病人预后有明显改善，但中晚期病人治疗效果不明显，5年生存率仍较低［1］。因此探究宫颈鳞癌相关因子有助于病人病情、临床疗效评估和病人预后改善。Qin 等［2］研究表明，泛素偶联酶E2（ubiquitin conjugating enzyme E2，UBE2C）在乳腺癌中高表达，与癌细胞对阿霉素敏感性降低和病人不良预后发生有关。有研究证实，子宫内膜癌组织中UBE2C 表达水平明显升高，预示病人晚期组织学分级、FIGO分期、复发和较短生存期。UBE2C 敲低可抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化［3］。有研究报道，与正常食管组织比较，食管癌组织中食管癌相关基因4（esophageal cancerrelated gene 4，ECRG4）水平显著下降，与癌细胞凋亡、周期、转移调控相关蛋白表达变化有关［4］。Tang 等［5］研究发现，乳腺癌组织中ECRG4 表达水平降低，过表达ECRG4 可导致G0/G1 期细胞周期停滞，抑制乳腺癌细胞增殖和迁移。本研究通过检测宫颈鳞癌组织中UBE2C、ECRG4 mRNA 及蛋白表达水平，分析二者在宫颈鳞癌发生发展中作用及与预后关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取天门市第一人民医院收治的宫颈鳞癌病人73例，选取时间为2010年6月至2014年6 月，病人年龄（51.26±16.83）岁，范围为37～71岁；其中有吸烟史19 例，孕次（2.35±0.71）次，产次（1.76±0.58）次。纳入标准：①均确诊为宫颈鳞癌［6］；②入组前未进行任何治疗；③临床资料完整。排除标准：①妊娠期、哺乳期病人；②合并患有其他妇科恶性肿瘤；③严重心、肾、肝脏功能不足病人。入组宫颈鳞癌病人根据FIGO 分期标准［6］，可分为：Ⅰ期10 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期45 例。其中Ⅰ～Ⅱ期病人行子宫广泛性切除+盆腔淋巴切除术，术后行辅助放疗5例：盆腔外、腹主动脉旁淋巴结照射（每次2 Gy，共40 Gy），阴道残端腔内照射（每次10 Gy，2～4 次）；术后行辅助化疗12 例：紫杉醇（75 mg/m2）+铂类（顺铂80 mg/m2）药物进行全身化疗，3 周1 疗程；术后行放化疗结合治疗11例：采用体外+腔内放疗方案，辅以紫杉醇（75 mg/m2）+铂类（顺铂80 mg/m2）药物治疗。Ⅲ期病人行均行放化疗结合治疗：盆腔外、腹主动脉旁淋巴结照射（每次2 Gy，共80 Gy），阴道残端腔内照射（每次10 Gy，5～7 次）；辅以紫杉醇（135 mg/m2）+铂类（顺铂80 mg/m2）药物治疗，3 周1 疗程，治疗2个疗程以上。

另选取同期本院收治的宫颈上皮瘤变病人62例为宫颈上皮瘤变组，病人年龄（50.52±15.89）岁，范围为35～70 岁；其中有吸烟史13 例，孕次（2.16±0.64）次，产次（1.51±0.52）次。纳入标准：①经阴道镜、宫颈液基细胞学、病理学诊断，确诊为宫颈鳞状上皮内瘤变［7］；②临床资料完整。排除标准：①有宫颈手术、盆腔放疗史；②有肿瘤药物治疗史；③妊娠期病人。入组上皮瘤变病人根据病理组织活检结果分为CIN Ⅱ级36例，CIN Ⅲ级26例。

选取同期行全子宫切除术的54 例子宫肌瘤病人为对照组，收集正常的宫颈组织（均经过病理检查），年龄（51.83±17.34）岁，范围为36～73岁；病人中有吸烟史9例，孕次（2.12±0.65）次，产次（1.37±0.43）次。纳入标准：①经病理学诊断和超声检查，确诊为子宫肌瘤［8］；②临床资料完整。排除标准：①近期无药物治疗史；②妊娠期、哺乳期病人；③未合并其他疾病。三组病人一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究所有受试者均已签署知情同意书，本研究经天门市第一人民医院伦理委员会批准同意（20100427）。

1.2 主要仪器和试剂实时荧光定量（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）仪（型号7500，美国ABI 公司）、RNA 提取试剂盒和免疫组织化学染色试剂盒（货号665077、1171939，德国Roche公司）、反转录试剂盒和qRT-PCR 试剂盒（货号RR047A、RR820A，日本Takara 公司）、兔抗人ECRG4 多克隆抗体（货号ABP56758，美国Abbkine 公司）、兔抗人UBE2C 多克隆抗体（货号PAB6221，台湾Abnova 公司）、羊抗兔IgG二抗（货号211-035-109，美国Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集术中分别收集Ⅰ～Ⅱ期宫颈鳞癌病人宫颈鳞癌组织、宫颈上皮内瘤变病人瘤变组织和子宫肌瘤病人正常宫颈组织，Ⅲ期宫颈鳞癌病人病理组织于病理检查时留存。将所得组织分为两份，一份保存于-80 ℃，用于检测UBE2C、ECRG4 mRNA 表达水平；另一份制成4 µm 厚石蜡切片，用于检测UBE2C、ECRG4蛋白表达。

1.3.2 UBE2C、ECRG4 mRNA 表达水平检测采用qRT-PCR 检测UBE2C、ECRG4 mRNA 表达水平，首先取收集组织在液氮中研磨，按照Trizol 法提取总RNA，然后反转录获得cDNA。反应体系（20µL）如下：cDNA 2 µL，ROX 0.4 µL，Mix 10 µL，上、下游引物各0.8 µL，dH2O 6.0 µL。反应步骤：95 ℃、30 s，1循环；95 ℃、5 s；65 ℃、15 s，40 循环；72 ℃、30 s。用2-ΔΔCt法计算UBE2C、ECRG4 mRNA 相对表达量。引物如表1所示。

1.3.3 UBE2C、ECRG4 蛋白表达水平检测UBE2C、ECRG4 蛋白表达水平按照免疫组织化学染色法进行检测。随机选取6 个视野（×400）观察，UBE2C、ECRG4 蛋白阳性细胞主要表达于细胞质，染色为棕黄色或棕褐色颗粒。染色强度：无、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别为0、1、2、3 分；阳性细胞百分比：＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分别为0、1、2、3、4分。根据染色强度和阳性细胞百分比评分乘积，将UBE2C、ECRG4 蛋白分为高表达（＞4分）和低表达（≤4分）［9］。

1.4 随访病人出院后，对73 例病人随访5 年，随访方式为打电话或复查，随访间隔为3 个月1 次，结束时间为2019 年6 月。随访结束后进行统计，并分析不同UBE2C、ECRG4 蛋白表达水平病人生存情况。无失访病例。

1.5 统计学方法用SPSS 23.0 软件对数据进行分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义再采用SNK-q检验；计数资料用例（%）表示，用χ2检验；采用Pearson 法分析宫颈鳞癌组织中UBE2C、ECRG4 mRNA 表达水平相关性；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，分析不同UBE2C、ECRG4 蛋白表达水平病人5 年总生存率，行log-rank 检验；采用Cox 回归模型进行危险因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组UBE2C、ECRG4 mRNA 表达水平比较与正常宫颈组织相比，宫颈上皮内瘤变组织和宫颈鳞癌组织中UBE2C mRNA 表达水平明显升高，ECRG4 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。与宫颈上皮内瘤变组织相比，宫颈鳞癌组织中UBE2C mRNA表达水平明显升高，ECRG4 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组泛素偶联酶E2（UBE2C）、食管癌相关基因4（ECRG4）mRNA表达水平比较/±s

表2 各组泛素偶联酶E2（UBE2C）、食管癌相关基因4（ECRG4）mRNA表达水平比较/±s

注：①与正常宫颈组织比较，P＜0.05。②与宫颈上皮内瘤变组织比较，P＜0.05。

组别正常宫颈组织宫颈上皮内瘤变组织宫颈鳞癌组织F值P值例数54 62 73 UBE2C mRNA 1.01±0.29 1.97±0.63①3.64±1.21①②157.71 0.000 ECRG4 mRNA 1.02±0.31 0.75±0.26①0.51±0.19①②63.72 0.000

2.2 各组UBE2C、ECRG4 蛋白表达水平比较UBE2C、ECRG4 蛋白主要表达于细胞质中，见图1。正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织、宫颈鳞癌组织中UBE2C、ECRG4 蛋白高表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 各组泛素偶联酶E2（UBE2C）、食管癌相关基因4（ECRG4）蛋白表达水平比较/例（%）

2.3 宫颈鳞癌组织中UBE2C、ECRG4 蛋白表达水平与临床病理特征关系不同分化程度病人癌组织中UBE2C 蛋白高表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同分化程度病人癌组织中ECRG4 蛋白高表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。FIGO分期Ⅲ期、淋巴结转移病人UBE2C 蛋白高表达率明显高于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移病人（P＜0.05），ECRG4 蛋白高表达率明显低于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移病人（P＜0.05）。不同年龄、肿瘤直径宫颈鳞癌病人癌组织中UBE2C、ECRG4蛋白高表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 泛素偶联酶E2（UBE2C）、食管癌相关基因4（ECRG4）蛋白表达与临床病理特征关系/例（%）

2.4 宫颈鳞癌组织中UBE2C、ECRG4 mRNA表达水平相关性宫颈鳞癌组织中UBE2C mRNA 与ECRG4 mRNA 表达水平呈负相关（r=-0.52，P=0.000）。见图2。

图2 宫颈鳞癌组织中UBE2C、ECRG4 mRNA表达水平相关性

2.5 UBE2C、ECRG4 蛋白表达水平与宫颈鳞癌病人预后关系 UBE2C 高表达组生存17 例，死亡33例，5 年总生存率为34.00%；UBE2C 低表达组生存15 例，死亡8 例，5 年总生存率为65.22%，UBE2C 高表达组与低表达组5 年总生存率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。ECRG4高表达组生存14例，死亡5 例，5 年总生存率为73.68%；ECRG4 低表达组生存18例，死亡36例，5年总生存率为33.33%，ECRG4高表达组与低表达组5 年总生存率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.6 宫颈鳞癌病人不良预后危险因素分析 FIGO分期Ⅲ期、淋巴结转移、UBE2C高表达、ECRG4低表达是影响宫颈鳞癌病人发生不良预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表5。

表5 Cox回归模型宫颈鳞癌病人不良预后危险因素分析

3 讨论

UBE2C 又称泛素结合酶（UBH10），属于泛素偶联酶E2 家族，位于人类染色体20q13.12 区，有6 种同源异构体，在泛素蛋白酶体有丝分裂调控系统中发挥重要生物学作用［10］。有研究报道，直肠癌组织中UBE2C 表达水平明显上调，体外干扰其表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭［10］。本研究得出，UBE2C mRNA 和蛋白表达上调可能与宫颈癌发生有关。Hu 等［11］研究证实，下调UBE2C 表达可抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和提高前列腺癌小鼠存活率。本研究结果显示，不同分化程度病人癌组织中UBE2C高表达率比较差异有统计学意义，且FIGO 分期Ⅲ期、淋巴结转移病人UBE2C 蛋白高表达率明显高于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移病人，提示UBE2C 蛋白表达水平升高可能与宫颈鳞癌进展有关。Jin等［12］研究发现，UBE2C在非小细胞肺癌组织中表达水平高于癌旁组织，可通过靶向结合上皮细胞标记蛋白E-cadherin 抑制因子ZEB1/2 转录本的5'-UTR 来促进肺癌细胞间充质转化，影响癌细胞周期和抑制凋亡来促进非小细胞肺癌进展和转移。上述研究提示UBE2C 可能通过上调细胞上皮间充质转化促进宫颈鳞癌发生发展。

ECRG4 位于人类染色体2q14.1-14.3 上，是一种由148个氨基酸残基组成的跨膜蛋白。肺癌细胞中ECRG4 表达下调，体外过表达ECRG4 可降低肺癌细胞增殖能力［13］。本研究通过检测ECRG4 mRNA和蛋白表达，发现ECRG4表达下调可能预示宫颈鳞癌发生。有研究表明，胃癌组织中ECRG4 表达下调，与肿瘤淋巴结转移密切相关，可能作为胃癌治疗靶点［14］。本研究结果显示，不同分化程度病人癌组织中ECRG4蛋白高表达率比较，差异有统计学意义。FIGO 分期Ⅲ期、淋巴结转移病人ECRG4 蛋白高表达率明显低于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移病人，提示ECRG4 可能参与宫颈鳞癌进展，癌组织中ECRG4 蛋白高表达率升高与可能与肿瘤分化程度降低、FIGO 分期Ⅲ期、淋巴结转移发生有关。Ge等［15］研究证实，ECRG4表达下调可影响上皮间充质转化相关标志物水平，促进肝癌细胞增殖和迁移，提示ECRG4 可能影响上皮间充质转化过程，参与宫颈鳞癌进展。

Li 等［16］研究表明，ECRG4 在食管癌中表达下调，ECRG4 过表达可通过下调UBE2C，影响癌细胞NF-κB 核易位，诱导细胞凋亡及抑制细胞增殖。本研究利用Peason 法对宫颈鳞癌组织中UBE2C、ECRG4 mRNA 表达进行了相关性分析，结果显示二者呈负相关，提示宫颈鳞癌组织中ECRG4也可能通过靶向调节UBE2C表达，影响宫颈鳞癌发生发展。

Zhang 等［17］研究报道，胃癌组织中UBE2C 过表达与病人预后不良有关，UBE2C 表达、淋巴结转移、TNM 分期是病人预后独立影响因素。Chen 等［18］研究发现，鼻咽癌组织中ECRG4蛋白表达水平明显低于癌旁组织，与淋巴结转移、临床分期呈负相关，是病人生存期较低的独立影响因素。本研究结果显示，UBE2C蛋白高表达组和ECRG4蛋白低表达组病人5 年总生存率较低，提示UBE2C 高表达、ECRG4低表达可能导致宫颈鳞癌病人术后5 年低生存率。本研究还发现，UBE2C 高表达、ECRG4 低表达、FIGO 分期Ⅲ期、淋巴结转移是影响病人不良预后的独立危险因素，进一步提示UBE2C 高表达、ECRG4低表达与宫颈鳞癌不良预后发生有关。

综上所述，宫颈鳞癌组织中UBE2C mRNA 表达水平及蛋白高表达率明显升高，ECRG4 mRNA 表达水平及蛋白高表达率降低，与病人临床病理特征及5 年总生存率低有关，可能作为评估病人不良预后的预测指标。但由于本研究方法较为简单，具体作用机制还需进一步探究。

（本文图1见插图5-1）

图1 UBE2C、ECRG4蛋白表达（免疫组化染色×400）：A为UBE2C蛋白在正常宫颈组织中低表达；B为UBE2C蛋白在宫颈鳞癌组织中高表达；C为ECRG4蛋白在宫颈鳞癌组织中低表达；D为ECRG4蛋白在正常宫颈组织中高表达