白骨化骨骼的DNA 检验1 例

周 安 江煜灵

(1.东莞市公安局厚街分局，广东 东莞523960；2.东莞市公安局，广东 东莞 523000）

近年来，随着DNA 提取技术的不断进步，骨骼DNA 检验方法也得到迅速的发展，检验效率以及检出成功率不断提高。对于高度腐败尸体、白骨化尸体能够成功检出骨骼STR分型是寻找尸源的可靠手段之一，但是一些陈旧白骨化的骨骼类案件中，由于骨骼经过风吹雨打、长期暴晒或者湿润等恶劣环境，污染极其严重，DNA 高度降解，增加了种属鉴定和DNA 检验的难度，成为法医物证检验鉴定领域中的一大难题。本文通过对1例白骨化无名尸体中骨骼的成功检验，探讨了脱钙结合磁珠法提取陈旧骨骼DNA的检验方法。

1 材料与方法

1.1 检材来源

2019年3月某日，报警人报警称，其在广东省东莞市某镇路边发现一个白色化肥编织袋，袋内装有一副残缺的疑似人体的骸骨，后于2019年3月某日送检2根疑似人体股骨和2020 年4 月某日送检2 根疑似人体肱骨，要求做DNA检验。

1.2 检材的预处理

仔细观察送检的股骨和肱骨，发现均已白骨化，没有软组织附着，外表有少量污垢。遂取股骨和肱骨各2 根，股骨编为A、B 号，肱骨编为C、D 号。使用手术刀片刮清洗骨骼表面污物和骨腔表面层，放置在84 消毒液浸泡10min 后，纯水多次冲洗干净，切取宽约6mm骨密质薄片2片，薄片放置于无水乙醇浸泡10min，将骨薄片剪成块状，滤纸擦干晾干备用。

1.3 DNA提取

采用螯合剂0.5mol/L EDTA（PH=8.0）溶液浸泡骨块4h脱钙，取各骨块分别置于Freez⁃erMill 冷冻研磨仪，在液氮低温环境下研磨至粉末状，每份3g 骨粉放入10mL 的离心管内，按骨骼专用磁珠法DNA 提取试剂盒（长春博坤公司）添加对应比例的蛋白酶K 和骨粉孵育液。混匀后置于56℃水浴恒温12h，骨粉期间摇匀，补加一次蛋白酶K 225µL，继续56℃水浴恒温12h。离心取上清溶液，加入吸附液和超顺磁性磁珠，充分摇匀后，吸取底部沉淀磁珠到提取试剂条，使用FL 案件专用型DNA 提取试剂盒（长春博坤公司，Kingfisher提取仪专用）提取骨粉模板DNA，洗脱体积30µL并收集。

1.4 PCR扩增及电泳

使用Verifiler Plus 复合扩增试剂盒（ABI公司，美国）进行扩增，反应体系10µL，其中 DNA 模板溶液 2µL，PCR 反应混合液 8µL（含有 Master mix additive 的 Master Mix 2µL，Primer Mix 1µL，纯水5µL），扩增在ABI Veriti 96 well thermal cycler 上进行，扩增产物经ABI-3500XL 遗传分析仪电泳后，使用Gen⁃eMarker V1.90软件进行分型。

2 实验结果

股骨所得STR 分型结果（见图1、图2），肱骨所得STR 分型结果（见图3、图4），均能成功检测有效分型。

图1 白骨化股骨A检出的STR分型图谱

图2 白骨化股骨B检出的STR分型图谱

图3 白骨化肱骨C检出的STR分型图谱

图4 白骨化肱骨D检出的STR分型图谱

由上述图谱可见，所送检材骨骼获得的STR 电泳图谱清晰，24 个基因座（图为女性，缺少Yindel）均能显示出峰，各基因座等位基因的峰高和分布均衡性较好，符合GA/T 1163—2014 的标准要求，但由于检材降解因素，大片段基因座的峰值较低。

3 讨论

3.1 检材选取

本案送检的骨骼已经成白骨化，时间经历较久，但整副骨骼较为完整，没有遭受严重破坏。选取股骨和肱骨进行DNA 检验，因为这两个部位骨骼DNA 含量相对较多，DNA检出率较高［1］。

3.2 污染控制

本案骨骼在白色化肥编织袋里发现，初步判断是人为放置骨骼入编织袋内，骨骼表面相对干净，但无法排除是否有外源性DNA附着在内，同时白骨化骨骼为疑难检材，DNA 含量较低，因此检验过程的污染控制十分重要，需做好以下几点：首先，需做好检验鉴定人员的保护以及检验工具的清洁与消毒，保证检材在检验过程中不受污染；其次，在骨骼检验前，必须对其进行充分的去污处理，排除外源性DNA 的污染干扰；再次，由于该案无比对样品，同一骨块检材要分开检验，至少要独立检验二次，若是男性个体，至少应做常STR 和Y-STR 多态性检验，若是女性个体应做常STR 和mtDNA（条件允许下）多态性检验，确保能够发现污染，及时排除干扰峰，从而提高结果的准确性和可溯源。

3.3 检验方法

在骨骼处理过程中应注意以下几点：（1）脱钙环节，人体骨组织的细胞间质主要由胶原质和羟基磷灰石构成，加入EDTA 使羟基磷灰石的钙离子断裂，有利于骨骼结构疏松，易于裂解。由于预处理刮除骨骼表层组织，采用先脱钙后研磨的思路，本案脱钙时间尝试在较短的时间中完成，避免了骨骼长时间脱钙后DNA 含量严重损失的问题［2］，保留脱钙液待复检核对，骨骼的分型图谱结果显示均获得较完整的STR 分型。（2）研磨环节，本案的骨骼使用液氮低温研磨机进行研磨处理，使检材一直处于低温保护中，保证研磨过程中检材DNA 不会发生降解或变性，同时样品一直处于在液氮研磨槽中，避免在外界交叉污染的风险［3］。（3）磁珠转移，在磁珠与骨粉裂解溶液下，吸取磁珠转移到试剂条［4］进行DNA 提取，磁珠能充分吸附骨粉的DNA，有效提高DNA 的产量，达到检验高成功率。磁珠转移法可以避免DNA 的污染和损失，该法操作相比其他提取方法［5-6］简单方便，不易污染。

综上所述，本文采用骨骼专用磁珠法DNA 提取试剂盒法结合Verifiler Plus 复合扩增试剂盒检验骨骼DNA，收集磁珠后一步转移即可，检验时间得到缩短，效率得到进一步提高，具有操作简单便利，试剂经济安全，DNA 产量高，能够快速获得完整的DNA 分型等特点，能满足实际常规检验的要求，此方法适合于基层法医对陈旧骨骼的DNA 进行检验。