嗜盐菌群对酸性大红 GR 的脱色特性研究

陈庭跃,马俊杰,李厚霖,赵嘉义,郭 光，丁克强

(南京工程学院环境工程学院,南京 211167)

引 言

随着印染技术的不断发展，人工合成染料被广泛应用。据统计，我国每年大概有20亿t印染废水排入水环境，约占工业废水总排放量的十分之一，造成了极大的水体污染[1]。印染废水具有色度深、毒性大、有机污染物含量高、难生物降解的有机物成分高、含有致癌物等特点。偶氮染料是应用最为广泛的合成染料，占人工合成染料产品总量的 80%[2]。偶氮染料还具有致癌、致畸、致突变作用及生物难降解性[3]。

目前，物理法、化学法和生物法是处理印染废水的主要技术。虽然物理和化学法脱色效果好，但费用较高，COD去除效果较差并且易产生二次污染。相比之下，生物法具有能耗低、成本低、环境友好等优点，从而被广泛应用于染料废水处理[4]。微生物通常合成特定的酶，如偶氮还原酶和漆酶等，从而使偶氮键断裂，形成苯胺类化合物等[5]。但是，高盐抑制了微生物对偶氮染料的降解。在印染过程中，为了提高着色效果，大量无机盐加入到染色过程，导致印染废水的含盐量都很高。高盐导致微生物质壁分离，抑制普通微生物的活性。嗜盐微生物可以在盐环境中生存，突破普通微生物的瓶颈，高效的降解偶氮染料。虽然目前已经分离出一些嗜盐菌，但不同菌株的底物范围和降解条件都不同，因此，需要筛选更高效的嗜盐微生物。因此，本实验富集了在 5%盐度下能使酸性大红 GR 高效脱色的嗜盐菌群，并研究了其脱色特性，为高盐印染废水生物强化处理提供菌种资源。

1 材料和方法

1.1 培养基和菌群的富集方法

5%盐度培养基[6]：Na2SO40.5 (g/L)；NH4Cl (0.3 g/L)；CaCl2(0.1 g/L)；KH2PO4(0.2 g/L);KCl (0.5 g/L)；MgCl2·6H2O (6.0 g/L)；NaCl (40.0 g/L)；乳糖 (1.0 g/L)；pH 7.0 ；1×105Pa 灭菌 30 min。

模拟印染废水：5%盐度培养基加入染料。

嗜盐菌群：将10 mL印染废水处理的活性污泥加入100 mL的5%模拟印染废水中(酸性大红GR浓度为100 mg/L)，2周后按照10%的比例接入新鲜模拟印染废水中，待脱色稳定后，富集培养结束。

1.2 菌群的群落结构分析

采用Fast DNA Spin Kit 试剂盒提取微生物基因组DNA。使用 Illumina Mi Seq PE250 测序仪高通量测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，筛选和拼接所有数据序列，经过OTU分析与聚类分析，最后通过Sliva数据库(http://www.arb-silva.de/)中的已知数据比对代表性序列、注释物种并统计群落结构。

1.3 菌群降解酸性大红 GR 的影响因素

将菌群接入5% 盐度培养基(酸性大红GR浓度为100 mg/L)中培养，20 h 后按10%的比例将菌液接种到不同碳源、氮源、盐度、pH 和浓度的5%盐度培养基(酸性大红GR染浓度为 100 mg/L)中。碳源和氮源分别替换5%盐度培养基中的乳糖和 NH4Cl，碳源浓度为1 g/L。

1.4 菌株对其他染料的降解

将菌液接种到含不同偶氮染料的 5% 盐度培养基中，染料浓度均为100 mg/L。染料包括酸性紫(542 nm)、直接黑G (636 nm)、酸性金黄G (425 nm)、直接粉(538nm)、直接蓝2B (598 nm)和酸性黑(636 nm)，20 h后测定脱色率。

1.5 染料浓度的测定和脱色率的计算

将脱色液在 12 000 r/min 下离心 5 min，取上清液，以未加染料的培养基作空白，在染料的相应波长下测量吸光度。脱色率的计算按照下式进行。

式中A0为初始时刻染料的吸光度；At为 t 时刻染料的吸光度。实验设置3组重复。

1.6 紫外/可见吸收光谱分析

取浓度为100 mg/L 酸性大红GR溶液、降解10 h和20 h离心后的上清液，用紫外可见分光光度计在波长190～900 nm范围内进行扫描。

2 结果和讨论

2.1 菌群的富集

本研究经过10次富集，从印染废水中获得了一个能够在5%盐度下降解酸性大红 GR的嗜盐菌群。在5%盐度下，20 h的脱色率达到 95.56% (100 mg/L)。脱色结束后，微生物显示为白色，没有染料的颜色，说明该菌群通过降解作用将酸性大红GR脱色，这和其他的研究结果相似[7](结果没有显示)。该菌群在静置条件下比震荡条件下脱色率高，是由于氧气比酸性大红GR更容易成为电子受体[8]。所以，后续实验选用静置的方法研究。

2.2 嗜盐菌群的群落结构

高通量测序结果表明(图 1)，该菌群主要由海细菌属、卓贝尔氏菌、肠球菌、日勾维多细菌源菌、替斯崔纳菌、梭菌、污泥螺菌属等组成。它们分别占全部序列的39.76%、21.38%、13.57%、11.31%、7.08%、2.52%和1.96%。海细菌属于嗜盐菌，可以适应高盐环境，本课题组富集的其他降解偶氮染料的菌群中也发现该菌[9]。本课题组已经从该菌群中分离出该菌，证明该菌能降解偶氮染料，相关研究正在进行中。卓贝尔氏菌可以在多种盐度下脱氮，但目前还没有降解偶氮染料的报道。肠球菌是兼性厌氧菌，其中Enterococcussp.L2中含有偶氮还原酶基因，可降解多种偶氮染料[10]。日勾维多细菌源菌可降解n-酰基高丝氨酸内酯[11]，替斯崔纳菌可降解多环芳烃和农药毒死蜱等[12-13]，梭菌属于梭菌目是厌氧嗜盐菌，目前没有发现这三种菌参与染料脱色的研究，说明自然界中还有很多降解偶氮染料的微生物资源。

图1 微生物菌群的群落结构

2.3 碳源和氮源对菌群脱色效率的影响

微生物共代谢是微生物降解偶氮染料的重要方式。从图 2可以看出，碳源对嗜盐菌群脱色酸性大红GR影响较大。乳糖和酵母粉促进嗜盐菌群脱色的效率最好，20 h 后的脱色率分别达到98.56%和94.95%为，其次为麦芽糖(77.96%)，葡萄糖( 62.06%)，蔗糖为(60.77%)，淀粉的效果最差，只有17.58%。共代谢促进微生物脱色偶氮染料，主要是因为共代谢基质可以作为电子供体，提高偶氮还原酶的活性[14]。乳糖促进脱色的效果最好，后续实验采用乳糖作为共代谢碳源。

图2 碳源对嗜盐菌群脱色效率的影响

碳源也影响嗜盐菌群对酸性大红GR的脱色效果(图 3)。所有氮源中，尿素和氯化铵的脱色率最高，20 h 后分别达到 97.48%和 95.77%。而蛋白胨24 h后的脱色率为 86.07%。牛肉膏的促进效果最低，仅为 59.73%。有研究发现，尿素可以促进 NADH 的再生，从而促进微生物对偶氮染料的脱色[15]。

图3 氮源对嗜盐菌群脱色效率的影响

2.4 pH 对菌群脱色效率的影响

pH 是影响微生物降解的重要因素，影响染料染料的跨膜转运，从而影响微生物的降解[16]。从图4可以看出，嗜盐菌群在pH 7对酸性大红GR的脱色率最高，达到 95.77%。其次为pH 6，20 h的脱色率为93.83%。过高和过低pH导致脱色率降低，pH 8、9 和 10 时，脱色率分别为65.27%、27.44%和26.26%。嗜盐菌群在 pH 4时达到最低，脱色率只有13.50%。pH变化抑制部分微生物生长，活性降低，抑制微生物脱色[16]。同时pH通过影响酶的活性导致脱色率下降。

图4 pH 对嗜盐菌群脱色效率的影响

2.5 染料浓度对菌群脱色效率的影响

酸性大红GR浓度影响对嗜盐菌群的脱色(图 5)。在100～400 mg/L范围内，当酸性大红GR浓度为100 mg/L时，20 h的脱色率达到 94.74%。浓度升高，微生物需要更多的时间降解偶氮染料。当浓度为 400 mg/L，嗜盐菌群也能高效脱色，126 h的脱色率为93.73%。偶氮染料具有毒性，浓度越高，毒性越大，从而抑制微生物的活性[17]。同时，偶氮染料降解产生的苯胺类也具有毒性，导致微生物的脱色率下降[18]。本研究富集的嗜盐菌群可以高效降解400 mg/L的酸性大红GR，同时也有较广的浓度降解范围，对处理偶氮染料废水具有较高的应用价值。

2.6 盐度对菌群脱色效率的影响

为了提高染料的固着效果，染色过程中经常会添加无机盐，导致印染废水的盐度升高。盐度对微生物降解酸性大红GR的影响如图 6 所示。在盐度5%时，嗜盐菌群的脱色率最高，达到96.06%。随着盐度升高和降低，脱色率都明显降低，在0%盐度时20 h的脱色率为21.80%。在20%的脱色率最低，脱色率只有6.30%。盐度是嗜盐菌生长的必须的条件，盐度降低也会导致微生物活性下降，甚至死亡；但是盐度过高会导致微生物脱水，活性降低，抑制细菌的活性[19]。此外，盐度升高使微生物合成更多的胞外聚合物，影响微生物的代谢方向，脱色率降低[20]。本研究富集的嗜盐菌可以在3%～10%范围内降解偶氮染料，在高盐印染废水中具有应用潜力。

图6 盐度对嗜盐菌群脱色效率的影响

2.7 菌群对不同偶氮染料的脱色

偶氮染料的化学结构也影响嗜盐菌的脱色效果(图 7)。20 h 后，酸性大红 GR几乎完全脱色(脱色率为 95.58%)，其次是酸性金黄(92.30%)、酸性紫 (76.49%)、直接黑(71.58%)、直接粉(69.41%)、直接蓝2B (65.16%)、酸性黑(32.02%)和。微生物更容易降解结构简单、分子量较小的偶氮染料[2]。此外，偶氮染料中芳香环上的取代基种类也影响微生物的降解[21]。酸性紫、酸性金黄只有一个偶氮键，容易降解。而酸性紫中含有抑制基团磺酸基(-SO3H)，所以比酸洗金黄的降解率低。酸性黑、直接黑包含两个偶氮键，且结构复杂，所以脱色率较低，这和他人的结果相同[22]。

图7 嗜盐菌群对不同偶氮染料的脱色效果

2.8 紫外/可见吸收光谱分析

紫外/可见吸收光谱的结果表明，嗜盐菌降解酸性大红GR后的偶氮键破坏，导致酸性大红GR的颜色降低(图 8)。酸性大红 GR 在510 nm有明显的吸收峰，这与他人的结果相同[23]。经过11 h后，510 nm的吸收峰降低，20 h后，该峰完全消失，证明微生物主要通过降解破坏偶氮键，使酸性大红GR脱色。

图8 染料脱色过程的紫外-可见光扫描图

3 结 论

3.1 采用富集的方法，从印染废水的活性污泥中富集了一个能够使酸性大红GR 脱色的嗜盐菌群，该菌群主要由菌群主要由海细菌属、卓贝尔氏菌和肠球菌等7个属组成。

3.2 该菌群的最适脱色条件是pH=7，5%盐度，共代谢底物是酵母粉和乳糖，最佳氮源为氯化铵和尿素，底物浓度100 mg/L，20 h的脱色率达到94%。

3.3 该菌群可以在100～400 mg/L浓度内高效脱色酸性大红GR；还可以脱色酸性金黄、酸性紫、直接黑和直接粉等偶氮染料。该菌群通过偶氮键断裂降解酸性大红GR。

3.4 该嗜盐菌群脱色效果好，为高盐印染废水处理提供了菌种资源和理论依据，在高盐印染废水处理中具有很高的应用价值。