紫杉醇调控NF-κB通路对FLT3-ITD突变急性髓细胞白血病细胞株MOLM-13增殖和凋亡的影响*

周宝文，吴梅青，石泽延，白子文，姚奕斌，刘振芳,庞如利，赵卫华

（广西医科大学第一附属医院血液内科，南宁 530021）

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是由于造血细胞增殖能力提高、分化阻滞、凋亡障碍而引起的一类血液系统恶性肿瘤。其中，20%～30%的患者存在FLT3-ITD突变，此类患者往往诱导化疗不容易缓解，易复发，预后较差，且约有75%初次诊断时携带有FLT3-ITD突变的患者复发时仍携带此突变[1-2]。美国国立综合癌症网络（NCCN）和欧洲白血病网络（ELN）均将其列为AML患者预后不良的重要指标[3-4]。目前，FLT3抑制剂靶向联合化疗虽取得了较好的疗效，但耐药的出现带来了更大的挑战，寻找新的联合药物是应对耐药的重要策略[5]。1992年美国食品和药物管理局（FDA）已批准紫杉醇（paclitaxel，PTX）用于晚期卵巢癌的治疗，此后PTX被广泛应用于各种实体瘤的治疗如乳腺癌、结直肠癌、膀胱鳞状细胞癌、头颈癌、小细胞和非小细胞肺癌等[6-7]。PTX在杀伤肿瘤细胞的同时对免疫细胞还有调节功能[8]。近年来，一些基础研究表明PTX能够诱导不同类型白血病细胞发生凋亡[9]。本研究旨在探讨PTX在体外对FLT3-ITD突变AML细胞株MOLM-13增殖与凋亡的作用，并进一步探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞株FLT3-ITD突变AML细胞株MOLM-13购自南京科佰生物科技有限公司；FLT3未突变AML细胞株THP-1购自广州赛库生物技术有限公司。

1.2药品、主要试剂及仪器PTX（上海源叶生物科技有限公司）；培养基及胎牛血清（Gibco）；CCK8试剂盒（美仑生物技术有限公司）；流式细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司）；Trizol RNA提取试剂和逆转录以及RT-qPCR试剂盒（大连Takara公司）。引物由生工生物工程股份有限公司合成。抗FLT3抗体、抗NF-κB抗体、磷酸化（p）NF-κB抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG均购自CST公司。

1.3细胞培养MOLM-13细胞和THP-1细胞均用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640完全培养液在37℃、5%CO2条件下培养，每2～3 d换液1次，取对数生长期、状态良好的细胞用于实验。

1.4 CCK8法测定PTX对MOLM-13和THP-1细胞增殖的影响 本实验设对照组（含有1‰DMSO溶剂）和实验组（2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L、10 nmol/L PTX），将细胞浓度调整为5×105个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每组4个复孔，每孔100μL，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10μL的CCK8溶液，37℃孵育2 h，用酶标仪测定各孔450 nm处的吸光度（OD）值。按以下公式计算细胞存活率：存活率=[（实验组-空白组OD值）/（对照组-空白组OD值）]×100%。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 实验设为对照组（含有1‰DMSO溶剂）和实验组（4 nmol/L、8 nmol/L PTX），处理48 h后，分别收集MOLM-13细胞和THP-1细胞，PBS洗涤细胞，用Binding Buffer重悬细胞，加入5μL Annexin Ⅴ，常温避光孵育15 min，加入5μL PI以及300μL Binding Buffer，轻轻混匀，用流式细胞仪检测。流式凋亡图左上象限（Q1）表示坏死的细胞，右上象限（Q2）表示晚期凋亡细胞，右下象限（Q3）表示早期凋亡细胞，左下象限（Q4）表示正常的细胞。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.6实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）检测FLT3、NF-κB基因表达 实验设对照组（含有1‰DMSO溶剂）和实验组（4 nmol/L、8 nmol/L PTX），处理48 h后，收集MOLM-13细胞，用trizol提取总RNA，逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性30 s；95℃变性5 s；60℃退火、延伸30 s，共40个循环。GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。引物序列：GAPDH上游：5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，下游：5’-TAAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’；FLT3上游：5’-GCAATCATAAGCACCAGCCAGGAG-3’，下游：5’-TTCTGCGAGCACTTGAGGTTTCC-3’；NF-κB上游：5’-CCCGTGGTATCAGACGCCAT-3’，下游：5’-TCCTCCCCTCCAGTCACACA-3’。

1.7 Western blotting法检测FLT3、NF-κB蛋白表达

收集MOLM-13细胞，PBS洗涤，按比例加入RIPA（10μg/mL）裂解液和蛋白酶抑制剂，置于冰上充分裂解30 min后，4℃、12 000 r/min离心20 min，小心吸取上清液，为总蛋白液。采用BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白上样后，十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳2～3 h，湿法恒流转膜1～2 h，封闭液封闭30 min。一抗（FLT3、NF-κB、p-NF-κB）稀释倍数1∶1 000，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次8 min；二抗[辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG]稀释倍数1∶5 000，室温孵育1～2 h，TBST漂洗3次，每次8 min；滴加ECL发光液，在凝胶成像系统中曝光。用Image J软件对各蛋白条带灰度值进行定量分析。

1.8统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析以及半数抑制浓度（IC50）计算，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTX对MOLM-13和THP-1细胞增殖的影响

通过CCK8检测不同浓度不同时间的PTX处理后MOLM-13和THP-1细胞活性，不同浓度的PTX作用于MOLM-13和THP-1细胞后，细胞存活率均有下降，呈剂量和时间依赖性，见图1。其中，PTX作用于MOLM-13细胞24 h、48 h、72 h的IC50分别为7.659 nmol/L、3.748 nmol/L、3.408 nmol/L；而PTX作用于THP-1细胞24 h、48 h、72 h的IC50分别为61.164 nmol/L、11.804 nmol/L、9.834 nmol/L。

图1 不同浓度PTX作用不同时间对MOLM-13和THP-1细胞增殖的影响

2.2 PTX对MOLM-13和THP-1细胞凋亡的影响

不同浓度的PTX（0 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L）作用MOLM-13和THP-1细胞。PTX处理后的MOLM-13细胞凋亡率、早期凋亡率均高于对照组（0 nmol/L PTX组）（P＜0.05）。而4 nmol/L PTX处理后的THP-1细胞凋亡率、早期凋亡率与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；8 nmol/L PTX处理后的THP-1细胞凋亡率、早期凋亡率升高（P＜0.05），见表1。且相同浓度的PTX作用下，4 nmol/L PTX组、8 nmol/L PTX组中MOLM-13细胞的凋亡率、早期凋亡率均高于THP-1细胞（均P＜0.05），见图2。

图2 不同浓度PTX作用48 h对MOLM-13和THP-1 细胞凋亡的影响

表1 不同浓度PTX处理48 h对MOLM-13和THP-1细胞凋亡的影响

表1 不同浓度PTX处理48 h对MOLM-13和THP-1细胞凋亡的影响

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 PTX作用MOLM-13细胞株后对FLT3、NF-κB基因的影响 不同浓度的PTX（0 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L）作用MOLM-13细胞48 h后，与对照组（0 nmol/L PTX组）相比，实验组（4 nmol/L、8 nmol/L PTX）FLT3mRNA相对表达量降低，且随着PTX剂量的增加而降低（P＜0.05），见图3。4 nmol/L的PTX作用MOLM-13细胞48 h后，NF-κBmRNA相对表达量无明显变化，而8 nmol/L的PTX作用MOLM-13细胞48 h后，与对照组（0 nmol/L PTX）相比，NF-κBmRNA相对表达量降低（P＜0.01），见图3。

图3 PTX对MOLM-13细胞FLT3、NF-κB基因表达的影响

2.4 PTX作用MOLM-13细胞株后对FLT3、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达的影响PTX作用于MOLM-13细胞48 h后FLT3蛋白表达量与对照组（0 nmol/L PTX组）相比降低（P＜0.05）。4 nmol/L的PTX作用MOLM-13细胞48 h后NF-κB蛋白表达量无明显变化，而8 nmol/L的PTX作用MOLM-13细胞48 h后，与0 nmol/L PTX组相比，NF-κB蛋白表达量降低（P＜0.05），见图4。4 nmol/L与8 nmol/L PTX作用于MOLM-13细胞48 h后，两组细胞p-NF-κB蛋白表达量与对照组（0 nmol/L PTX组）相比均降低（P＜0.05），见图4。

图4 不同浓度PTX处理48 h对MOLM-13细胞蛋白表达的影响

3 讨论

近年来，随着造血干细胞移植技术的成熟应用和靶向药物进入临床，AML的治疗取得了很多新的突破。FLT3抑制剂如索拉菲尼、米朵妥林、奎扎替尼等均在复发/难治性AML的治疗中显示出了显著的临床效果[10]。一项研究表明，采取同种异体造血干细胞移植和FLT3抑制剂治疗的FLT3-ITD突变阳性的AML患者，有更大的比例在连续几年内达到完全缓解，相应的中位生存期和中位复发时间延长[11]。但同时也有研究表明，FLT3-ITD突变阳性的AML患者即使进行了异基因造血干细胞移植，复发的风险也很高[12]。而FL3抑制剂治疗也面临着单药抗性小、耐药等问题[10]。耐药与复发仍是FLT3-ITD阳性AML治疗中存在的难题，寻找和尝试新的有效的治疗药物是提高疗效的关键。

PTX是一种微管稳定剂，其主要作用机制是通过诱导和促进微管蛋白聚合、抑制微管解聚、诱导细胞周期阻滞及促进凋亡。有研究表明，PTX可诱导原代慢性淋巴细胞白血病细胞的凋亡[8, 13]。本研究将PTX应用于AML细胞MOLM-13和THP-1，结果显示PTX可抑制MOLM-13和THP-1细胞生长，且发现24 h、48 h、72 h PTX对FLT3-ITD突变阳性的细胞株MOLM-13的IC50均小于该突变阴性的THP-1细胞株。相较于THP-1细胞，PTX诱导MOLM-13细胞凋亡，且随着PTX浓度的增加，细胞数量逐渐减少，说明PTX能特异性地抑制MOLM-13细胞增殖与诱导凋亡。同时本课题组也证实了PTX还能抑制FLT3基因和蛋白的表达，可以推测PTX对FLT3突变存在特异性的作用。本课题组前期实验已经证实PTX能抑制MOLM-13细胞增殖，且与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性有关。而PI3K/AKT和（或）RAS/MEK/MAPK通路的激活，以及FLT3介导的细胞转化相关基因的持续表达是FLT3激酶抑制剂耐药的机制之一[14]。

NF-κB是广泛存在于各种类型细胞中的一种转录因子，其被发现在许多实体肿瘤和血液恶性肿瘤中异常激活，使得肿瘤细胞异常增殖和耐药[15]。在AML中，FLT3-ITD突变或过表达FLT3会激活NFκB，使得NF-κB成组性地与DNA结合[16-17]。而在本实验中，8 nmol/L的PTX能降低MOLM-13细胞中NF-κB基因和蛋白的表达，4 nmol/L PTX可能是由于时间或剂量的关系没有发挥抑制作用；同时PTX也能抑制MOLM-13中磷酸化NF-κB蛋白的表达，可以推测PTX是通过抑制NF-κB通路，从而抑制MOLM-13细胞的增殖及诱导其凋亡的。

综上，PTX对FLT3-ITD突变阳性AML细胞株存在抑制增殖和诱导凋亡作用，其诱导凋亡作用是通过抑制FLT3和NF-κB mRNA和蛋白表达实现。该研究为PTX治疗AML提供了理论基础，有望提高FLT3-ITD突变阳性AML的治疗效果，为AML化疗联合药物提供了新的思路。今后拟将PTX应用于荷瘤小鼠以及AML原代细胞中，进一步阐明其对FLT3-ITD突变阳性AML的体内、外抗肿瘤作用，为临床治疗提供实验基础。