EGFL6对骨血管生成的调控机制研究进展*

廖世杰，宋方茗，陈凯，唐生平，徐家科△

（1.广西医科大学第一附属医院 广西再生医学研究中心，南宁 530021；2.广西医科大学 广西再生医学重点实验室，南宁 530021；3.西澳大利亚大学 生物医学与科学学院，珀斯澳大利亚 6009）

骨具有高度的再生性，其生长和重塑过程经由无数的细胞活动密切协调。除成骨细胞和破骨细胞起主要作用外[1-2]，内皮细胞参与的血管生成也是维持机体骨稳态动态平衡的重要一环[3]。骨组织中广泛存在的血管网络能运输成骨细胞和破骨细胞前体、生长因子及营养物质以满足骨骼的生长、代谢需求[4-5]，血管内皮细胞还能产生多种成骨特性的内分泌因子调控机体骨稳态[6]。一些细胞因子如血管内皮生长因子A（VEGF-A）、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在骨血管生成过程中的作用已被研究证实[7-8]，积极探索新的血管生成因子及其作用机制尤为重要。

表皮生长因子样结构域6（epidermal growth factor-like domain，EGFL6）是由成骨细胞特异性分泌的促血管生成因子，能在骨修复过程中偶联血管生成与成骨。明确EGFL6调控骨血管生成的机制，有望为骨愈合受损、骨质疏松、骨坏死等临床难题提供新思路。

1 EGFL6 的分子特征

EGFL基因家族因能编码包含单个或多个EGFL的蛋白而得名，能激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、细胞外信号调节激酶（ERK）、核因子-ĸB（NF-ĸB）及Notch等重要信号传导通路介导如细胞迁移、黏附、增殖、分化[9]及胚胎发育、肿瘤发生、血管生成[10]等广泛的生物学活动。

EGFL家族成员包括EGFL2、EGFL3、EGFL5、EGFL6、EGFL7、EGFL8和EGFL9等，其中EGFL6、EGFL7可编码生长因子参与血管生成的调节，是目前研究的热点。EGFL7在成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞均有表达，能促进骨局部环境及某些肿瘤的内皮细胞迁移、血管生成[9,11]。EGFL6也被称为MAEG，位于人的Xp22染色体上，由Yeung等[12]在1999年通过DNA分子杂交高通量筛选而发现。EGFL6蛋白分子结构包括1个N端信号肽结构域、1个整合素结合位点（RGD）、5个EGF样重复结构域和1个C端MAM结构域[13]。EGFL6蛋白中位于N端的信号肽区提示其可能是一种分泌蛋白[12]；RGD基序可与整合素受体结合诱导细胞增殖、分化[14-16]；EGFL样重复结构域包含30～40个氨基酸残基，与表皮生长因子（EGF）有着显著同源性，可通过蛋白质间的相互作用发挥生物学功能[5]；位于C端的MAM结构域被认为能够发挥黏附功能[17]。此外，EGFL6还有2个潜在的N-糖基化位点和1个潜在的酪氨酸磷酸化位点，提示EGFL6可能作为一种激酶底物，通过磷酸化来调节表达或调节功能[12]。

EGFL6最初发现主要作用于胎儿的早期发育，随后在成熟脂肪细胞、毛囊、躯干真皮组织、颅面区间质及某些肿瘤中也发现其存在[18-21]。骨骼系统与EGFL6的联系最早由Chim等[20]的研究所揭示，笔者发现EGFL6能在成骨细胞中特异性地表达，且与内皮细胞的迁移、血管形成关系密切。近年来学者们不断深入对EGFL6的研究，展示其在成骨细胞与血管内皮细胞的交互中发挥着重要作用。

2 EGFL6 调控骨血管生成的相关机制

作为富含血管的组织，骨的形成过程并非孤立，而是与骨血管的生成紧密联系且相互促进，二者在时间、空间上的关系称为“血管生成-成骨偶联”作用[22]。高表达CD31和内皮黏蛋白（EMCN）的H型血管在骨修复中地位重要，H型内皮细胞能分泌许多刺激骨祖细胞增殖和分化的因子来调节成骨，可作为评估局部骨血管生长状况及成骨能力强弱的标志[22-24]。目前认为，骨重塑发生在一个称为骨重塑室的特殊血管结构中，其内包含的成骨细胞、破骨细胞、骨细胞以及内皮细胞、周细胞等细胞能紧密协作，调控复杂而有序的骨修复活动[5,25-26]。

骨重塑室中，内皮细胞可分泌骨形态发生蛋白（BMP）、成纤维细胞生长因子（FGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等成骨因子影响骨的生长和重塑[6]；而成骨细胞能旁分泌EGFL6作用于临近的血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移及管状结构形成，同时能增强内皮细胞VEGF-A的表达，诱导H型血管生成。骨愈合受损、骨坏死等由于局部血运的缺乏是目前临床治疗的难题，促进血管生成和血供恢复是治疗的关键。EGFL6经由多种途径调控血管生成（图1），了解其作用机制，有助于加深对骨修复、骨血管重建的认识。

图1 EGFL6偶联成骨与血管生成

2.1 EGFL6与MAPK/ERK信号通路 随着对EGFL6的研究逐步展开，其在骨血管生成的作用机制也在不断地被揭示。MAPK/ERK信号通路是EGFL6调控骨血管生成的重要一环，该通路属于蛋白质-丝氨酸/苏氨酸激酶级联反应，参与了细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等生物学过程[27-28]。研究发现，EGFL7能通过结合EGFR激活ERK信号通路，调控骨血管生成[11]。

Chim等[20]首次发现并研究了EGFL6对骨疾病作用，探索了EGFL6是否经由MAPK/ERK信号通路影响骨血管生成。该研究首先验证了EGFL6是一种分泌蛋白，随后体外实验发现含有EGFL6的条件培养基不仅能增强内皮细胞的迁移，还能诱导内皮细胞管状结构的形成与鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成。与对照组相比，EGFL6组的内皮细胞中磷酸化ERK（p-ERK）的表达水平显著升高，进一步抑制ERK通路，EGFL6诱导内皮细胞迁移及小管形成的能力被显著抑制。Shen等[29]的研究显示，经EGFL6处理后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）中p-ERK1/2的表达水平也可发生不同程度的改变。此外，Chim等[20]的研究发现外源性EGFL6不诱导成骨细胞增殖和矿化，这与本课题组的实验结果相佐证—成骨细胞以胞内分泌EGFL6的方式经由MAPK等信号通路内源性促进成骨[30]，同时也提示EGFL6能偶联成骨与血管生成。以上研究结果证明了EGFL6可通过ERK信号在血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成等方面参与骨血管生成过程。EGFL6可在体外经MAPK/ERK信号通路促进骨与血管生成，但其在生物体内如小鼠模型中的作用以及具体的细胞间通讯形式，还有待进一步探索。

2.2 EGFL6与Wnt/β-catenin信号通路Wnt信号通路是一个复杂的调控网络，在细胞增殖、分化、黏附和凋亡等多种过程中发挥作用，该通路包括3个主要分支：经典Wnt通路（即Wnt/β-catenin通路）、Wnt/PCP通路及Wnt/Ca2+通路。其中，Wnt/β-catenin信号通路在骨的正常生长及代谢中的地位重要，能参与调控BMSCs、成骨细胞以及破骨细胞的增殖、分化[31-32]。

Shen等[29]研究发现，重组EGFL6蛋白可以促进HUVECs的增殖、迁移和小管形成，促进CD31表达及EMCN的内皮细胞形成；此外，通过RT-qPCR、western blotting等实验发现，EGFL6可增强体外HUVECs和BMSCs中β-catenin和活性β-catenin的表达。在大鼠牵张成骨模型中，免疫荧光实验也检测到经EGFL6干预后牵张间隙活性β-catenin的增加，表明Wnt/β-catenin信号通路是EGFL6促进血管生成和骨生成的一个潜在机制[29]。而Wnt信号通路的抑制剂DKK1只能部分抑制由EGFL6诱导的BMSCs成骨分化及成骨相关蛋白（如CXCR4、Runx2）的上调，提示此信号通路可能仅为EGFL6调控网络中的一部分，还有其他信号传导通路参与其中。该实验表明外源性EGFL6增强了体外BMSCs的成骨分化，并通过刺激血管生成加速骨再生。

2.3 EGFL6与BMP/Smad信号通路BMP信号通路是以BMP为核心和启动位点的完整信号系统，包括典型的Smad途径和非典型的MAPK途径[33]，在骨骼发育、骨形成和骨稳态调节过程中至关重要。BMP作为一种分泌型的多功能细胞因子，参与了各种器官的形成和维持过程，其中BMP-2能诱导BMSCs向成骨细胞分化，并增加骨钙素等成骨相关因子的表达从而促进骨形成[34]。另外，在所有的Smad蛋白中Smad1/5/8与成骨细胞的分化密切相关，被磷酸化的Smad1/5/8（p-Smad1/5/8）与Smad4结合形成复合体，调节相关靶基因的转录[34-35]。

BMP/Smad信号通路作为诱导成骨分化的重要信号，经分泌蛋白EGFL6的调控在增强骨与血管偶联、促进骨血管生成中扮演重要角色。本课题组实验发现，成骨细胞来源的EFGL6不仅能促进血管内皮细胞增殖、迁移及诱导骨血管的生成，还能调控成骨分化而间接促进血管的生成。过表达EGFL6的BMSCs成骨能力增强；而沉默EGFL6的BMSCs成骨能力明显减弱，表现为矿化程度降低并伴有关键成骨基因（如Bglap、Sp7和Runx2）的表达下调。用BMP-2干预过表达或沉默EGFL6的BMSCs后，可检测到过表达组p-Smad1/5/8较沉默组明显增高，提示EGFL6能通过激活BMP/Smad信号通路调控成骨分化[30]。此外，外源性的EGFL6能促进体外内皮细胞形成管状结构，却对成骨细胞的增殖及矿化能力无明显影响[20]。但Liu等[36]研究发现，外源性重组EGFL6蛋白可通过调控BMP-2/Smad4信号通路促进脂肪来源的间充质干细胞向成骨细胞方向分化，这与Shen等[29]的研究结果相似。由于Shen等[29]使用的是含有EGFL6部分片段的重组蛋白，而本课题组使用的是EGFL6的全长蛋白，所以笔者初步猜想不同来源的重组EGFL6蛋白具有的分子差异性可能是导致实验结果产生差异的原因，同时也提示外源性EGFL6蛋白对成骨分化的生物效应可能具有片段特异性。

2.4 EGFL6与其他分子 除上述列举信号通路外，一些相关分子可能参与EGFL6对骨血管生成的调控。例如，在胚胎时期EGFL6通过与整合素β1结合激活ERK相关信号通路，参与脊椎动物胚胎血管发育[37]。转录因子Twist1可与EGFL6启动子结合激活下游信号，随着Twist1的表达量增加可在一定程度提高EGFL6的转录活性，促进伤口血管生成及愈合[16]；非编码RNA miR-6086可以直接与EGFL6 mRNA结合负向调控卵巢癌的肿瘤生长和血管生成[38]，描述了EGFL6可能的上游调控机制。经典的促血管生成因子VEGF-A在过表达EGFL6的BMSCs中表达上调，而在敲除EGFL6的BMSCs中表达下降[30]，可以猜测成骨细胞分化过程中EGFL6可能是VEGF-A的上游调节剂，二者相互协作以调节骨微环境中的血管生成和成骨。肾连蛋白（NPNT）与EGFL6相似，拥有EGF样重复结构域，能促进成骨细胞分化、矿化以及骨血管的生成[39-40]，有研究显示，皮肤毛囊缺乏NPNT可导致EGFL6代偿性地表达上调[19]。骨血管生成是一个多因素交叉作用的复杂过程，多种信号通路与相关分子可能同时参与了此过程的调控，随着未来研究的深入，期待更多EGFL6调控网络新成员的发现。

3 EGFL6 调控骨血管生成相关的动物模型

选择合适的动物模型有助于体内实验的开展，对揭示EGFL6的作用机制具有重要意义。因繁殖周期短、成本较低、遗传背景明确等优点，啮齿类动物是骨修复实验的优选动物模型[41]。其中，大鼠、小鼠是目前用于研究EGFL6调控骨修复的主要动物。

牵张成骨模型与其他模型相比，能从时间和空间角度反应骨重建的病理过程，可以更直观地表现骨重塑部位血管生成的情况。Shen等[29]在大鼠胫骨中段建造了牵张成骨模型，随后将外源性的EGFL6蛋白注入牵张间隙中，利用影像学、组织学及免疫学方法发现EGFL6同时促进了H型毛细血管及新生骨的形成，新血管能沿着新生骨组织围绕成柱状，向着牵张间隙延伸从而加速骨愈合。该大鼠模型实验提示，提高局部EGFL6的浓度可能是促进骨缺损修复和骨折愈合的方法，为未来EGFL6的临床应用提供了动物实验基础，但最适蛋白浓度、是否存在其他调节因子代偿以及是否对人体有效仍需进一步研究。

另一方面，本课题组利用基因敲除技术构建了EGFL6敲除的小鼠模型，发现生理状态下EGFL6的缺失不影响小鼠正常骨表型的发展，EGFL6敲除小鼠意外地表现出与对照组无明显差异的身高、体重以及骨小梁、骨皮质参数[30]。这或许表明EGFL6在生理状态下的骨发育过程中不占主要地位，亦或提示存在其他代偿性的血管因子弥补了EGFL6的缺失，所以解决哪些因素可以弥补EGFL6的损失也是未来的工作方向之一。而在EGFL6敲除小鼠制造胫骨单皮质骨缺损后，缺损区域的H型血管和表达Runx2的成骨细胞显著减少，导致骨愈合延迟，表明骨修复的病理状态下，EGFL6作为一种关键的调节因子对骨与血管的生成至关重要。

4 总结与展望

目前针对EGFL6的研究多见于肿瘤领域，但随着研究的深入，其在骨修复重塑中的作用越发引人注目。血管生成是骨生长、骨重塑以及病理性骨疾病的重要组成部分。EGFL6或许在正常生理状态下对骨生长不起主要作用，但在病理状态下的骨缺损修复过程中则是不可或缺的，其可经多种信号通路及相关分子调控成骨细胞与血管内皮细胞之间的交互，偶联成骨与血管生成，促进骨组织的修复与再生。但对于EGFL6的具体作用机制还需进一步挖掘，如EGFL6是通过内源性还是外源性的方式促进成骨分化；除上述通路外是否还存在其他作用通路，有无某条优势通路在EGFL6调控网络中起主导作用；EGFL6上游的调控机制、具体的分子靶点及其在其他骨疾病中的作用等。

综上所述，深入研究EGFL6在骨微环境中调控血管生成的作用机制，加深对骨重建及血管再生的认识，有助于为骨愈合受损、骨坏死等临床骨病的治疗提供一个理想的靶点。