外泌体对乳腺癌诊疗一体化影响的研究进展

侯建勋 综述 王洪斌 审校

世界卫生组织预估了全球180多个国家将近40种癌症类型的最新流行情况，以及癌症的预后与发展趋势。根据这项最新的预估数据，全球乳腺癌新发病例超过了肺癌，成为了全球第一大癌症。乳腺癌在女性恶性肿瘤中的发病率为第1位，死亡率为女性的第5位，对女性产生了巨大的伤害。乳腺癌的病因是多因素的，随着生活方式的改变，其发病率也会随之发生变化。如今，人们对乳腺癌的研究已经取得了巨大的进展，从乳腺癌的发生发展到转移侵袭，从药物治疗到临床手术治疗，再到分子靶向治疗。但要促进乳腺癌在诊疗方面的发展，仍需要进一步探索新的治疗靶点及其对乳腺癌诊断以及预后的影响。

1 外泌体

1.1 外泌体介绍

外泌体是指包含很多复杂RNA和蛋白质的小膜泡结构，它广泛存在并分布于各种体液中，它是一种主要的胞外囊泡(EVs)，携带大量特异性的蛋白质和功能性物质，参与细胞间物质和信息的传递，包括肿瘤转移、免疫、心脑血管、干细胞治疗，以及肿瘤以外的免疫调节、靶向给药、组织损伤修复等，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，是一种理想的生物标记物。随着研究的不断深入，科学家们发现在乳腺癌发生发展的不同阶段，在包括机体耐药、免疫微环境、肿瘤的侵袭和转移、药物载体运输、调控细胞因子的分泌和表达等方面，外泌体作为一种潜在的肿瘤生物标记物在乳腺癌的诊断和治疗中均起着不同程度的作用。外泌体可携带多种细胞组成成分，如细胞膜蛋白、DNA和RNA，可以参与细胞间通讯，具有多种生物学功能及广泛的临床应用[1]。外泌体除了在细胞间有良好的通讯功能，还具有良好的药代动力学特性，可在生物体内运输多种物质，如细胞成分方面的小干扰RNA(siRNA)，乳腺癌治疗方面的化疗药物及其载体，免疫调节剂和分子靶向药物。外泌体的生物相容性和不良反应少的特质使得疾病的发生发展与治疗的反应性和预后也都可通过外泌体的多重组分分析方法来确定。

1.2 外泌体的提取和检测

目前有一些研究机构已经建立许多关于外泌体研究的数据库，如Vesiclepedia、ExoCarta、EVpedia、EVmiRNA、exoR-Base及ExoBCD等，为外泌体的研究提供了重要资源。外泌体的分离提取方法多种多样，主要有超速离心法、超滤法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法、排阻色谱法、流控芯片技术等，但这些方法有其各自的局限性[2-3]。提取外泌体使用最多的方法是超速离心法，更多的研究人员通常联合使用两种方法来分离纯化外泌体[4]。

外泌体活体示踪简单的说就是用一些特殊的示踪剂，如放射核素、荧光蛋白、亲脂性染料、造影剂、同位素等标记外泌体，用放射同位素不断发出特定射线的核物理性质和亲脂性染料显示的标记实现追踪，从而观察外泌体在生物体内的位置和行为，高转移性乳腺癌来源的外泌体在体外会表现出自我归巢和体内选择性分布。

目前的活体成像方法有很多，常用的主要有核素分子成像、光学成像和磁共振成像等。但是亲脂染料和荧光蛋白标记外泌体都有各自的缺点，给外泌体检测的敏感性带来了挑战[5]。有研究人员开发了一类高效、多指标检测的膜融合囊泡，通过这种融合蛋白和多肽的更精确筛选，在一定程度上可以提高囊泡的融合效率，通过多种核酸分子信标的同时包载，实现多种肿瘤特异外泌体小RNA(miRNA)的同步检测，获得更丰富的肿瘤诊断信息[6]。

2 外泌体在乳腺癌诊断中的作用

乳腺肿瘤中的外泌体可用来诊断乳腺癌，肿瘤的治疗效果可以由肿瘤的外泌体变化反映出来，相关研究成果表明，外泌体能作为液体活检的目标待测物用于乳腺癌的诊断。如果将机体细胞成分如细胞膜表面蛋白和RNA等联合应用于癌症诊断和预后评估，会在一定程度上增强乳腺癌诊断的特异性和敏感性。外泌体miRNA作为乳腺癌重要的诊断指标已被广泛认可，但是目前检测外泌体miRNA的方法仍存在耗时、回收效率低的问题。提取miRNA时需破坏外泌体，造成miRNA损失并影响检测结果的准确性。所以基于外泌体表面蛋白的液体活检在乳腺癌和其他疾病的诊断上具有潜在应用价值，同时其诊断灵敏性和可行性还有待进一步提高。

3 外泌体对乳腺癌治疗的影响

3.1 外泌体与机体耐药

研究表明，耐药性是可以通过外泌体在细胞之间传递的，外泌体携带细胞中高表达的P-gp，以mRNA的形式传递信息，进而使敏感细胞产生耐药性，不过其具体机制尚待进一步研究[7]。

外泌体相关的乳腺癌耐药总结有以下几个方面：肿瘤细胞通过外泌体直接排出药物；外泌体核酸载体介导耐药。外泌体中介导乳腺癌细胞耐药的长链非编码RNA(lncRNA)存在于细胞核或细胞质中，可以被包装到外泌体中，并作为细胞间通讯信使[8]；外泌体介导的miRNA与乳腺癌耐药有很大的关系[9]。有研究表明，耐他莫昔芬乳腺癌细胞在某种程度上会通过外泌体这一特殊结构来传递miR-9-5p耐药性，一旦解决了乳腺癌患者对药物治疗的不良耐受这将会是乳腺癌治疗上的重大突破。同时这项研究也发现，MCF-7细胞对TAM(肿瘤相关巨噬细胞)的抵抗力会因为microRNA-9-5p(miR-9-5p)外泌体的转移而增强；与此同时，乳腺癌细胞对TAM的敏感性也因miR-9-5p而发生了改变[10]；外泌体蛋白载体介导耐药性以及外泌体介导的竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络在乳腺癌的耐药过程中发挥着重要的作用。外泌体在乳腺癌中介导的几种耐药模式和机制见表1。

3.2 免疫与外泌体的相关性

肿瘤的发生发展和转移与肿瘤微环境(TME)密不可分，而肿瘤和TME之间不断的相互影响促进癌症的生长，其中很大一部分是由外泌体介导的。Jena等[18]研究发现，肿瘤来源的外泌体影响成纤维细胞(CAFs)分化，而CAFs通过外泌体的分泌来调控肿瘤发生；肿瘤来源的外泌体直接影响免疫细胞向TME的募集和迁移，而免疫细胞来源的外泌体也是乳腺癌细胞迁移和转移的重要贡献者。外泌体的数量和质量也取决于微环境的pH值[19]。因此，深入了解肿瘤与微环境之间的这种双向相互作用机制，是开发新治疗策略的必要条件。了解乳腺癌细胞外泌体的相关发展不仅对了解乳腺癌的转移进展有重要意义，而且在限制目前临床和临床前免疫治疗的有效性方面也有重要意义[20]。此外，在对乳腺癌的治疗方面，Koh等[21]开发了一种以增强吞噬作用为目的外泌体，即使是低剂量也能发挥抗肿瘤的作用。

表1 外泌体在乳腺癌中介导的几种耐药模式和机制

3.3 外泌体与乳腺癌的侵袭和转移

外泌体通过影响肿瘤细胞代谢增殖的微环境来促进乳腺癌细胞转移[22-23]；外泌体促进肿瘤血管生成也是乳腺癌肿瘤发生侵袭的条件之一；外泌体有关的上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程与影响TME有异曲同工之妙，都会促进乳腺癌的侵袭和转移。通过靶细胞的表型变化会诱导非恶性乳腺肿瘤细胞恶性度发生改变，细胞侵袭转移能力增加能刺激巨噬细胞极化，这一改变也是乳腺癌转移的有利条件之一；乳腺癌转移患者外泌体MMP9表达升高，为乳腺癌转移预警和术后复发监测提供了一个新的靶点[24]；外泌体PD-1高表达能够协助肿瘤免疫逃逸和增强其对化疗药物的耐药性；脂肪MSC-Exo通过激活Hippo信号通路促进MCF-7细胞生长和转移[25]，这些都是外泌体介导乳腺癌发生侵袭和转移的有力证据。

3.4 外泌体与药物载体运输

外泌体具有存在于体内的广泛性和方便获取的便捷性，其作为药物等运载体具有能被受体细胞吸收、免疫原性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强等优点[26-27]。

外泌体能够通过血脑屏障的这一特殊性质，使其在药物输送中发挥了重要作用，并在乳腺癌的药物治疗方面功不可没，甚至会对以后乳腺癌药物治疗中出现的研究瓶颈有所帮助。外泌体载药会作为常用策略来减轻化疗和分子靶向治疗副作用，提高疗效和减轻耐药性以及化疗和分子靶向治疗的副作用。由于它起源于患者的生物系统，因此可以克服纳米载体的免疫原性、生物相容性、毒性、生物降解性等常见风险[28]。外泌体正逐步发展成为乳腺癌化疗药物递送的载体。目前，外泌体药物装载的主要方式有转染试剂法、超声法、冻融循环法和电穿孔法[29]。

3.5 外泌体调控分泌和表达

随着新的研究进展，新型药物能通过其他机制影响还原耐药性，还对外泌体的形成和释放有影响[30]，这些药物会以不同的方式影响外泌体的分泌和表达：磺胺异噁唑、卤夫酮、紫草素等多种药物可通过抑制外泌体的表达来发挥抗肿瘤作用。

物理相互作用和化学相互作用对乳腺肿瘤血管生成、ECM重构、细胞增殖、侵袭和耐药都发挥着关键作用，外泌体调控的化学相互作用其中一项就是细胞因子的分泌和表达[31]。不论是对肿瘤细胞的影响还是对药物作用的干扰，外泌体介导细胞间通讯的方式主要有以下几种：外泌体膜与靶细胞膜直接的相互作用；在细胞外基质中，外泌体膜蛋白被细胞中蛋白酶裂解，释放出与细胞膜结合的成分分子，进而激活细胞间信号传导通路；外泌体膜可以与靶细胞膜融合，导致外泌体蛋白、mRNA和miRNA的非选择性释放，由此可见，外泌体表面的配体/受体修饰作用也可以应用于乳腺癌的治疗[32]。

4 小结与展望

目前来看，乳腺癌治疗的主要发展趋势就是分子靶向治疗，它具有效果好且副作用少的优势。通过影响外泌体的合成、抑制外泌体分泌和靶细胞的摄取，可以改善乳腺癌的化疗耐药，外泌体相关联的乳腺癌耐药在体内和体外都有涉及，但目前的研究成果仅仅局限于体外，体内的作用机制还需要进一步探究，这很可能成为乳腺癌化疗耐药研究的新靶点，为乳腺癌的药物治疗提供新方向。除此以外，在最少的额外消耗下获取更大纯度的外泌体用于临床治疗也是一个挑战；如何将抗肿瘤药物或基因等物质高效加载到外泌体内仍然是亟需解决的技术问题之一。

目前的外泌体成像示踪剂在成像应用上尚缺乏多层次性，为了更好地追踪体内药物并因此而有助于治疗乳腺癌等其他疾病，多方向、多维度的示踪剂还需要进一步得到开发，虽是难点但同样也是研究热点。此外，外泌体的双向性质，如对乳腺肿瘤进展的贡献和对乳腺肿瘤生长的抑制，使得外泌体作为靶标分子治疗乳腺癌和开发新型药物具有更大的挑战性。新开发的药物对乳腺癌的治疗益处更多还是副作用更多也是需要考虑和探索的方面。大量的单独和协同的测试都要以外泌体内合成的不同物质为依据，以找到更优的方式加强乳腺癌的治疗效果。相信随着这些问题的解决，以外泌体为核心引导的乳腺癌诊疗一体化不久就会实现。