8周有氧运动对Nrf2敲除鼠骨骼肌抗氧化系统及运动能力的影响

刘雨佳 ，毛雅芸 ，张 缨 *

运动能力受到多种因素的影响，骨骼肌内的氧化还原状态是影响骨骼肌工作能力的重要因素。当骨骼肌内自由基生成增多超出了机体正常水平时，骨骼肌处于氧化应激状态，进而引起骨骼肌运动性疲劳。正常情况下，机体内存在着抗氧化系统，可以清除多余的自由基，使机体氧化还原状态保持平衡。在长时间大强度的运动中，骨骼肌处于缺血缺氧状态，由于运动中的能量需求增加，引起骨骼肌线粒体电子漏增加以及黄嘌呤代谢途径的激活，导致骨骼肌自由基生成增多（Jin et al.，2015，Kerksick et al.，2015），进而引起骨骼肌氧化还原状态失衡，使骨骼肌的收缩功能下降。

研究发现，核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2p45-related factor 2，Nrf2）在调节机体抗氧化系统中起到非常重要的作用。当机体处于氧化应激状态时，Nrf2受到自由基的激活，转运进入细胞核，识别并结合核内大部分抗氧化酶基因中都含有的特异DNA启动子序列——抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE），促进过氧化氢酶（CAT）、醌氧化还原酶（NQO1）和血红素加氧酶（HO-1）等一系列抗氧化酶基因转录的启动，从而上调多种保护性酶的表达，进而清除体内过多的自由基（Harvey et al.，2009；Leonard et al.，2006；Zhong et al.，2013）。

近年研究发现，Nrf2受到运动干预的影响。急性运动可以显著增强Nrf2活性，从而作用于抗氧化酶的表达（Li et al.，2015）；而长期有氧运动训练对Nrf2的作用和机制仍未完全明确，且长期有氧运动训练能否通过Nrf2通路增强骨骼肌工作能力仍有待进一步探索。因此，本研究采用Nrf2敲除鼠进行8周有氧运动训练，探讨Nrf2信号通路在有氧运动调节抗氧化系统和运动能力中的作用。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

8周龄雄性Nrf2敲除小鼠（Nrf2 KO鼠，购自中国医学科学院医学实验动物研究所）和同周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠（WT鼠，购自北京维通利华实验技术有限公司）各20只，敲除鼠和野生鼠均随机分为安静对照组和运动组，即野生安静组（WC组）、野生运动组（WE组）、敲除安静组（KC组）和敲除运动组（KE组），每组10只。动物房采用12∶12昼夜灯光循环照明，室内湿度控制在50%～70%，室温保持在22℃～25℃，自由饮食、饮水。

安静组小鼠正常笼中活动，运动组小鼠先进行1周适应性跑台训练，方案为：坡度0°，跑速12 m/min，持续时间15 min/天，运动频率5天/周。之后运动组采用正式训练方案：坡度 0°，跑速 12 m/min（约 75%V.O2max）（Fernando et al.，1993），运动强度持续时间60 min/天，运动频率5天/周，共8周。

1.2 运动能力测试

在运动训练8周后采用递增负荷强度测定小鼠运动能力。测试方案为：起始速度为10 m/min，持续5 min，然后跑速每3 min增加3 m/min直至力竭。记录小鼠达到力竭的跑速、时间和距离。力竭的判断标准为小鼠不能维持跑速，且电刺激10 s后仍不能坚持。

1.3 取材

所有小鼠取材均在最后一次运动后48 h进行。小鼠脱颈椎处死，立即取小鼠两侧股直肌下段，迅速称量，用锡纸包裹，标记，立刻投入液氮中。然后转入-80℃冰箱，保存待用。

1.4 组织ROS水平测定

细胞ROS水平测定采用GENMED（GMS10016.3）试剂盒，荧光比色法进行测定。取各组100 mg骨骼肌组织样品置于离心管，加入清理液A清洗，弃去清理液，用滤纸吸干。然后加入稀释液C，用剪刀将组织剪碎，匀浆。静置10 min后，4℃10 000 rpm离心10 min。取上清，BCA法测蛋白浓度。根据蛋白浓度将蛋白匀浆液稀释至20 μg/μL，取10 μL加入避光酶标板，按照试剂盒要求稀释染色液B，加入到含蛋白匀浆液的酶标板孔中，37℃避光孵育20 min，激发波长490 nm，散发波长520 nm检测荧光强度值。计算与空白荧光强度差值，以表示该孔细胞ROS含量。

1.5 RT-PCR法测定mRNA的表达

取50 mg的骨骼肌加入0.8 mL预冷Trizol中，剪碎，匀浆后，依次采用氯仿、异丙醇、75%酒精进行分离提纯总RNA，用紫外分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，采用RT-PCR试剂盒（Toyobo，FSQ101）将RNA逆转录为cDNA，然后用PCR扩增仪扩增。

采用美国ABI7500荧光定量PCR仪进行PCR扩增测定，引物分别采用Nrf2（QT00095270），过氧化氢酶（CAT；QT010558106），醌氧化还原酶1（NQO1；QT00094367）和血红素氧合酶（HO-1；QT00159915）。反应体系采用：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，引物 2 μL，CDNA模版2 μL，ddH2O 6 μL。使用ABI7500PCR仪自带的软件对实时荧光定量CT值进行读取，用比较CT法对目的基因表达结果进行相对定量。具体计算公式为：目的基因=2-△△C。

1.6 Western Blot测定蛋白表达

取100 mg冻存骨骼肌组织，加入1 mL含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液（碧云天）中。剪碎，高速匀浆；冰上静置30 min；12 000 rpm，4℃离心30 min，取上清液于离心管中，-20℃冻存备用。采用美国Pierce公司生产的蛋白浓度试剂盒，BCA方法测定骨骼肌的蛋白浓度。以上样蛋白量20 μg为一次上样量，根据测定的蛋白浓度计算蛋白上样量。采用美国life technologies公司产Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝胶，电泳分离Nrf2、CAT、NQO1、HO-1及内参（β-actin），然后采用美国Invitrogen公司的iBlot Gel Transfer System转移电泳胶将电泳后蛋白从凝胶转移至NC膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，4℃一抗过夜，一抗分别为 Nrf2（1∶200，Santa Cruz，SC-722），CAT（1∶500，Santa Cruz，SC-50508），NQO1（1∶500，Santa Cruz，SC-16464），HO-1（1∶1 000，abcam，ab13248），室温孵育摇床1 h，后用TBST洗膜3次，每次10 min。ECL发光显影，放入Bio-Rad凝胶成像仪中进行拍摄得到目的条带图像。用Image Lab软件读取条带的积分灰度值，用式（1）计算比值表示最后结果：

1.7 统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，数据采用平均值±标准误（M±SE）的形式显示，采用双因素方差分析方法，对干预方式（安静和运动训练）和不同基因型的主效应以及两因素的交互作用进行分析。如果无主效应，同种干预方式或同种基因型组间采用独立样本t检验，显著性水平取P＜0.05，非常显著性水平取P＜0.01。

2 研究结果

2.1 8周有氧运动对小鼠运动能力的影响

野生鼠和Nrf2敲除鼠的运动组的终止跑速、达到力竭时间和运动距离均显著高于各自安静组；而不同基因型鼠的同种干预方式间并未呈现出显著性差异（表1）。

表1 不同组别小鼠的运动能力Table 1 Exercise Capacity in Mice from Various Groups

2.2 8周有氧运动对Nrf2敲除鼠ROS的影响

与WC组相比，KC组小鼠ROS无显著变化，Nrf2敲除并未引起小鼠骨骼肌ROS水平升高；与WE组相比，KE组小鼠ROS水平显著下降（P＜0.05），8周有氧运动训练后野生鼠ROS高于Nrf2敲除鼠。WE组与WC组相比无显著性差异，KE组与KC组相比也无显著性差异（图1）。

图1 8周有氧运动对Nrf2敲除鼠骨骼肌ROS的影响Figure 1. Effects of 8 Weeks Exercise on ROS in Nrf2 Knockout Mice

2.3 8周有氧运动对Nrf2及抗氧化酶mRNA表达的影响

KC组小鼠Nrf2、NQO1和CAT mRNA非常显著低于WC组，但KC、WC组HO-1 mRNA表达无显著性差异；与WC组相比，WE组Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA非常显著升高，而Nrf2敲除鼠运动组与安静组间mRNA均无显著性差异（图2）。

图2 8周有氧运动对Nrf2敲除鼠骨骼肌Nrf2及抗氧化酶mRNA的影响Figure 2. Effects of 8 Weeks Exercise on mRNAof Nrf2 andAntioxidant Enzymes in Nrf2 Knockout Mice

2.4 8周有氧运动对Nrf2及抗氧化酶蛋白表达的影响

KC组与WC组相比，Nrf2蛋白表达非常显著降低，而NQO1、HO-1和CAT表达均无显著性差异；KE组与WE组相比，Nrf2及其调节的NQO1、HO-1和CAT的蛋白表达均显著降低。WE组与WC组相比，Nrf2及其调节的NQO1、HO-1和CAT的蛋白表达均无显著差异；KE组较KC组各蛋白无显著改变（图3）。

图3 8周有氧运动对Nrf2敲除鼠骨骼肌Nrf2及抗氧化酶蛋白表达的影响Figure 3. Effects of 8 Weeks Exercise on Expression of Nrf2 andAntioxidant Enzymes in Nrf2 Knockout Mice

3 分析讨论

3.1 Nrf2对运动能力的作用

有研究发现，运动作为一种应激，对骨骼肌中ROS的生成起到刺激作用（Powers et al.，2020）。Nrf2是细胞内氧化还原状态中关键的核转录因子。Nrf2可通过细胞内ROS激活，转运至细胞核内，调节多种抗氧化解毒酶的表达，进而清除ROS，维持细胞内氧化还原状态平衡。而Nrf2是否会受到运动的影响，进而提高运动能力？相关的研究仍没有明确结论。本研究发现，经过8周的有氧运动训练，野生鼠和Nrf2敲除鼠达到力竭的时间都呈现显著提高，但两种基因型小鼠间并没有显著性差异。Crilly等（2016）的研究结果与本研究一致，采用Nrf2敲除小鼠和野生鼠进行自由转轮训练6周，在最后一次运动后48 h进行最大运动能力测试，结果显示，两种基因型小鼠在运动后均比各自的安静组运动能力显著性增加，但Nrf2敲除小鼠达到力竭时的运动距离与野生鼠相比并无显著性差异。关于Nrf2对运动能力作用的研究结论并不一致，有研究采用外源性药物补充的方式激活Nrf2，发现Nrf2的激活增强了运动能力。如，Wafi等（2019）研究证明，姜黄素可以上调骨骼肌Nrf2信号，增强了骨骼肌的运动能力；Oh等（2017）研究发现，萝卜硫素（SFN）可以通过激活骨骼肌Nrf2，降低了力竭运动导致的骨骼肌氧化应激，从而使运动能力增强，且可以减少运动至力竭引起的骨骼肌结构损伤。研究结果的不一致可能与Nrf2的激活方式不同有关。结合本研究结果来看，有氧运动可以增强Nrf2敲除鼠和野生鼠的运动能力，但并不依赖于Nrf2系统实现运动能力的改善。

3.2 8周有氧运动对Nrf2敲除鼠骨骼肌ROS的影响

有研究发现，在Nrf2敲除状态下，多个器官ROS水平有所升高（He et al.，2009；Kovac et al.，2015），也有研究发现，Nrf2的缺失并未引起ROS以及氧化损伤标志物的增加（Gong et al.，2006；Osburn et al.，2006）。Muthusamy等（2012）对Nrf2敲除小鼠心肌ROS的检测发现，在一次性运动应激后，心肌ROS水平增加；而在基础状态下，Nrf2敲除鼠与野生鼠ROS水平并无显著性差异。因此，Nrf2敲除对ROS的影响，一方面是由于在体和离体状态下细胞或器官生存环境不同，另一方面，还跟细胞或器官的活动状态有关。本研究结果显示，在安静状态下Nrf2敲除鼠ROS水平与野生鼠无显著性差异，由此也说明ROS的生成不仅与Nrf2有关，可能存在其他的通路对骨骼肌中ROS的生成产生影响。本实验中动物取材时间选择在基础状态下，因而Nrf2敲除并未引起小鼠骨骼肌基础状态下氧化还原状态的失衡。

运动作为一种应激，可以影响线粒体的功能，使骨骼肌ROS水平增加（Saborido et al.，2011）。另有研究发现，规律性的运动训练也可以引起机体ROS的适应性变化。运动训练可以增强机体抗氧化系统的功能，且运动训练可能影响了线粒体和胞浆中ROS的生成（He et al.，2016）。Merry等（2016）研究发现，Nrf2除了调节抗氧化系统多种抗氧化酶的表达外，还可能影响细胞内线粒体代谢相关的酶。该研究通过对Nrf2敲除鼠V.O2max检测发现，Nrf2敲除鼠V.O2max也显著低于野生鼠，由此说明Nrf2敲除引起线粒体代谢功能下降，而ROS的生成也因此受到限制。在本研究中，KC组与WC组ROS水平相比无显著性差异，而KE组ROS水平低于WE组，这与最初的预期结果并不一致。ROS的生成与骨骼肌线粒体代谢关系密切。Kovac等（2015）研究发现，Nrf2通路参与调节了线粒体内NADPH氧化酶（NOX）的表达。Nrf2敲除鼠NOX4表达降低，而NOX2出现代偿性增加，这可能是ROS水平升高的原因。Crilly等（2016）研究发现，Nrf2敲除引起小鼠骨骼肌线粒体功能降低，而运动训练并不依赖Nrf2途径提高细胞色素c氧化酶4的表达，进而增强线粒体功能，这也可能是运动训练后导致Nrf2敲除鼠ROS水平低于安静组的原因。因此结合本研究结果推测，运动训练可能影响了Nrf2敲除鼠骨骼肌ROS水平，具体的机制仍有待进一步研究。

3.3 8周有氧运动对Nrf2敲除鼠骨骼肌抗氧化系统的影响

ROS除了引起氧化损伤外，在细胞内还担任着信号分子的作用，例如，Nrf2的激活就依赖于ROS。有氧运动训练引起Nrf2敲除鼠骨骼肌的抗氧化系统的适应性变化可能是通过对ROS的改变来起作用的（Merry et al.，2016）。近些年来关于长期耐力运动训练的研究发现，有氧耐力训练可以增加Nrf2及其调控的Ⅱ相解毒酶的表达和/或活性增加（Aguiar et al.，2016；Asghar et al.，2007；Camiletti-Moirón et al.，2014；da Silva Fiorin et al.，2016；George et al.，2009；Gounder et al.，2012；Jiang et al.，2014；Kumar et al.，2011；Muthusamy et al.，2012；Strobel et al.，2011；Sun et al.，2013；Zhao et al.，2013）。本研究结果显示，尽管在安静状态下，Nrf2敲除小鼠Nrf2、NQO1、HO-1和CAT抗氧化酶mRNA表达低于野生鼠，但NQO1、HO-1和CAT蛋白表达并未显著低于野生鼠。而KE组与WE相比，Nrf2、NQO1、HO-1和CAT的表达均显著降低。结合ROS水平的结果发现，Nrf2和抗氧化酶蛋白表达结果与ROS水平变化趋势相似，即在安静的基础状态下，Nrf2的缺失并未引起机体内ROS和抗氧化系统的明显差异，但在经过有氧运动训练后，ROS和抗氧化酶的表达出现差异。有氧运动训练可能增加了基础状态下的ROS水平，而NQO1、HO-1和CAT抗氧化酶的表达增加可能是对ROS的敏感性增加，这一运动适应性变化过程依赖于Nrf2的参与。

4 结论

8周有氧运动通过Nrf2促进骨骼肌抗氧化酶的表达。8周有氧运动增强了小鼠运动能力，但并不依赖于Nrf2发挥作用。