四川省某奶牛场犊牛呼吸道疾病的细菌性病原qPCR检测

陈久兵，耿尚景超，，王方国，，陈娅婷，周金伟，骆 巧，马 莉，姚学萍，余树民，沈留红，储岳峰，曹随忠，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州730046； 3.蒲江县农业农村局，四川 蒲江 611630)

牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease， BRD)俗称运输热，是由多种因素相互作用形成的呼吸系统疾病，包含环境因素(如断奶、运输、混群、拥挤和通风不良)，宿主自身因素和病原体等。由于此疾病与动物福利和高昂的经济成本相联系，国外对其进行了大量的研究，已证实其病原包括病毒、细菌和支原体等。其中常见的细菌性病原包含: 多杀性巴氏杆菌(，)、睡眠嗜血杆菌(，)、牛支原体(，)、化脓隐秘杆菌(，)和溶血性曼氏杆菌(，)等；病毒性病原主要包含：牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV)、牛副流感病毒3型(bovine paraffin virus 3， BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus， BRSV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus， BVDV)等。通常情况下，上述病原常形成混合型感染，因而往往需要借助实验室诊断才能确定病原体类型。

我国对BRD的相关研究起步较晚，国内关于奶牛BRD病原流行病学资料较少，2013—2015年张晓宇对我国西南、华南、华东、华北、华中和西北6个区域的集约化牧场进行牛呼吸道疾病流行情况调查，对80日龄以内的犊牛进行鼻拭子采样，并记录临床症状、发病日龄、发病率和病死率等，结果显示，BRD发病率随着日龄增长呈波浪形变化，发病第一个高峰出现在20～40日龄，发病率为62.49%，第二个高峰出现在犊牛断奶前后(60～80日龄)，发病率为59.44%。根据2007年美国动物健康监测系统调查(NAHMS)显示，奶犊牛断奶前的感染率为12.4%～16.4%，断奶后呼吸系统疾病的发病率为5.9%，是小犊牛死亡的主要原因(46.5%)。

不同国家和地区BRD暴发流行的病原微生物种类差异很大， 目前实验室检测BRD的方法有血清学检测、病原分离培养和PCR检测等，但大多数检测都是基于一种测定方法检测一种病原体，缺乏快速诊断的全面性。TaqMan荧光定量PCR检测方法是在RT-PCR基础上发展起来的一种核酸检测方法，具有快速、敏感、准确、定量检测微生物核酸拷贝数等优点。本实验参照Kishimoto等、Sachse等报道的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术，选择、、、和保守性和特异性较好的基因片段进行引物和探针设计，根据翟肖辉等、王方国研究中建立的反应条件和反应体系，对该5种常见BRD细菌病原进行检测。本研究利用该检测技术对四川某规模化奶牛养殖场BRD病原分子诊断，了解该牧场BRD相关致病性细菌病原的种类，为临床治疗与防控提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源及采集时间

2019年4、11月和2020年4月采集四川省某规模化奶牛场(存栏数2 199头，泌乳牛只1 127头)患有BRD的犊牛鼻腔棉拭子(分3批次共75份)和牛舍垫料、粪水、牛奶、水槽饮用水、料槽饲草混合物样品(各2份，均采自饮奶犊牛舍)，共85份，于-20 ℃保存。患有BRD犊牛的临床表现为不同程度的流鼻涕、咳嗽、精神沉郁、食欲下降、呼吸困难等。

1.2 主要试剂与仪器

CFX96荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)，质粒提取试剂盒(OMEGA Endo-free Plasmid Mini KitⅡD6950-01)购自广州飞扬生物工程有限公司，2×Goldstar TaqMan Mixture购自康为世纪有限公司，DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit，DP301-02)购自北京天根科技有限公司。

1.3 DNA的提取

用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取所有样品DNA，具体操作参考说明书，DNA于-20 ℃保存。

1.4 引物与探针

参照Kishimoto等、Sachse等报道的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术，由西安擎科生物有限公司分别合成、、、和相应引物和探针，引物探针信息见表1。

1.5 重组质粒的构建

根据GenBank中已公布的、、、和全基因序列，引物所处的位置和扩增目的条带长度，使用CloneManager8.0软件进行分析查找，选取拟扩增目的基因序列，合成并克隆到质粒载体pUC57，克隆位点Eco RV，载体长度2.7 kb，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成、克隆。具体序列见表2。

1.6 标准曲线的建立

根据翟肖辉等、王方国研究中设计的实时荧光定量PCR反应体系和反应程序进行扩增，用Elution Buffer缓冲液将各重组质粒分别做10×倍比梯度稀释、使其浓度分别为1×10～1×10拷贝·μL作为模板，进行扩增。 实时荧光定量PCR反应体系: 2×Goldstar TaqMan Mixture 10 μL，ddHO 7.5 μL，引物F(10 μmol·μL)0.5 μL，引物R(10 μmol·μL)0.5 μL，探针(10 μmol·μL)0.5 μL，模板1 μL。 反应程序：95 ℃预变性10 min后，再95 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s运行40个循环。扩增完成后，以质粒拷贝数的对数值Log()为轴，以Ct值为轴，建立标准曲线。

表1 qPCR检测的引物探针组

表2 目的基因序列

1.7 病原检测

参照文献[2，6-8]报道的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法分别对、、、和进行检测，阳性判定：Ct值≤10拷贝数，阴性判定：Ct值>10拷贝数。

1.8 统计分析

计算各病原菌的检出率、单一感染率及混合感染率。其中“某菌检出率”指某细菌所有检出样本数/总样本数，包括混合感染中该菌的检出样本数。而“单一感染率”指某一细菌单独检出样本数/总样本数，不包括混合感染中该菌的检出数。

试验数据采用SPSS 25.0软件进行卡方检验，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

TaqMan探针实时荧光定量PCR扩增结束后，根据Ct值构建标准曲线，并对相关系数、扩增效率进行评价。各质粒扩增效率分别在90.1%～100.3%，相关系数值为0.990～0.999。由此可见，各质粒浓度(拷贝数)与Ct值之间存在较好的线性关系。同时经中国农业科学院兰州兽医研究所翟肖辉等实验验证具有良好的特异性和敏感性。

2.2 病原检测结果

对75份鼻腔棉拭子样本中5种常见细菌性病原的检测结果显示，、、、和的检出率分别为 57.33%(43/75)、38.67%(29/75)、13.33%(10/75)、12.00%(9/75)、8.00%(6/75)。单一感染率为36.00%(27/75)，主要由引发，占24.00%(18/75)；混合感染率为 40.00%(30/75)，尤以和引发的混合感染为主，占18.67%(14/75)。75份样本中有18份样品未检出任何病原菌。在10份其他样本中有一份草料检测到了。单一或者混合感染率以及各细菌检出率检测情况见图1。

横坐标表示各细菌检出率；纵坐标柱状图代表感染率，每一行圆圈对应该行左侧相应细菌(灰色圆圈无代表性，圆圈颜色不特指某一细菌)，其对应纵坐标为感染率，两个圆圈或多个圆圈相连表示相应细菌间的混合感染情况。The abscissa indicated the detection rate of each bacteria. The vertical coordinate represented the infection rate， and each circles represented the corresponding bacteria on the left side of the row (the gray circle was not representative， and the color of circle did not refer to a particular bacteria)， that corresponding ordinate was the infection rate， and the connection of two or more circles indicated the mixed infection among the corresponding bacteria.图1 TaqMan-PCR检测方法对临床样品的检测情况Fig.1 The detection of clinical samples by TaqMan-PCR method

3个时间点采样检测结果如表3所示，不同时间点细菌检出率最高的分别是和。2020年4月检出率高于2019年4月和11月，有升高的趋势(>0.05)。2019年4月和11月检出率极显著高于2020年4月(<0.01)，2019年11月检出率显著高于2020年4月(<0.05)，2019年4月检出率显著高于2020年4月(<0.05)，、、3种细菌检出率随采样时间的推移均呈下降趋势。

表3 不同采样时间qPCR检测结果

3 讨论

BRD是由一系列感染因子和环境因素引起的一种牛呼吸系统疾病，对全世界养牛业造成了重大经济损失。一般认为细菌和支原体能加重BRD的暴发，当病毒感染牛呼吸道后，造成牛呼吸道上皮细胞受损和牛免疫系统受到抑制，从而细菌和支原体等病原体侵入牛下呼吸道，引起继发感染。同时某些细菌又能帮助BRD病毒逃避宿主防御，促进肺损伤，导致疾病加重。

和属于条件性致病菌，在本次鼻拭子检测中这两种病原菌的检出率分别高达57.33%和38.67%，且该两种细菌的混合感染率达18.67%，为主要混合感染模式。以其荚膜抗原和菌体抗原分血清型，国内牛源的以B:2型引起牛出血性败血症为主，近年发现A:3型是BRD中最常见的血清型。国内外可应用的疫苗主要是链霉素依赖的突变体研制的活疫苗和传统方法研制的灭活疫苗，但免疫保护率较低，且该菌B型疫苗对A型菌无交叉保护作用，加大了该菌的防控难度，使其在我国各养牛省区的检出率均较高。本研究3次检测中也有逐次递增的趋势，这种转变的潜在原因可能是该菌的毒力增强、牧场对生病犊牛识别和管理不当以及抗菌药物的选择不适等。多存在于犊牛的鼻咽区和下呼吸道，能与BRSV协同作用，促使肺泡细胞收缩和胶原蛋白降解增加，导致肺组织损伤加剧。在表现健康的犊牛呼吸道中能检测到该菌，但BRD牛群的检出率和病原浓度要明显高于正常牛。是国外引起BRD的重要病原菌，在巴西BRD牛中阳性率达39%，但国内少见与BRD相关的报道。本研究中为第二大优势菌，检出率远远超过了张颖慧等进行的四川省11个外地引种牛场该菌的检出率(5.6%)，可能原因是本实验采用的TaqMan荧光定量PCR方法比普通PCR及细菌分离培养方法敏感。同时表明该菌在我国可能广泛分布，有必要进一步开展其流行病学调查。

在此次检测中的阳性率为13.33%，低于西南三区(四川、重庆和昆明)39.37%。可能与本次检测仅在四川特定牛场特定时间段采样以及犊牛日龄偏小有关。国内外关于该病原的流行病学资料较多，虽然其在BRD发病机制中是原发性致病原还是机会性病原一直存在争议，但从检测到病原的犊牛群发现中耳炎、关节炎或肺炎症状可能会证实该病原的致病性。由于在环境中生存期有限，其主要通过直接接触被感染牛只或通过生殖道传播。对于饮奶犊牛还可通过摄入受污染的牛奶而感染，但多数养殖场的感染被认为主要通过接触鼻液传播，并且有证据表明应激或运输会增加鼻分泌物中的脱落。在本次检测的10份其他样品中(牛舍垫料、粪水、饮用乳液、水槽饮用水、料槽饲草混合物)，有一份料槽饲草混合物中检测到，同时第3批次鼻拭子样品中没有检测到该病原，说明该牧场的流行可能主要不是通过母源垂直传播，而是由后期接触传播导致。在本次病料检测中、和检出率的逐次降低可能与牧场加强完善疾病防控体系有关。

有相关实验表明，引起BRD的病原体之间存在协同关系：和、和、BVDV和、BVDV和BRSV、BoHV-1 和BVDV、BRSV 和。因为存在不同的协同关系，犊牛感染一种病原和不同病原的多重感染组合以及各病原体参与组织损伤的时间前后顺序不同，加大了根据病原对呼吸道疾病进行简单分类的难度，给牧场防控BRD带来极大挑战。本次综合鼻拭子检测结果显示，该5种呼吸道常见菌的单一感染率为36.00%，牛群混合感染率为40.00%，其中以和双重感染率最高达18.67%，且该两种菌与、呈四重感染检出率为2.67%，说明该牧场病原菌混合感染较严重。虽鼻腔棉拭子采样比支气管肺泡灌洗液、器官穿刺呼吸术的准确性较低，但易操作、快速且应激小，更适用于群体诊断。本次采集的75份患BRD犊牛的鼻拭子样本中有18份样品未检出任何病原菌，可能说明该牧场还存在其他病原。因此，结合临床症状和群体流行病史，联合使用血清学检测等技术，从不同生物学角度调查牛群感染状态，同时加强细菌耐药性监测，有助于牧场采取合适的防控方案。

4 结论

本实验在2019—2020年对四川省一规模化奶牛养殖场的75份有BRD牛的鼻腔棉拭子和10份其他样本进行、、、、病原检测，结果发现，5种常见BRD致病菌均有检出，说明该牧场感染病原种类较复杂，还可能存在其他牛呼吸道病原体。的高检出率表明其在我国BRD中的作用值得进一步研究。