碱发温度对毛肚胶原蛋白结构的影响

王立宇，夏杨毅,2, ，赵 鸾

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400700；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400700）

毛肚口感独特，作为火锅特色菜品发展潜力巨大。新鲜毛肚通常采用食用碱或蛋白酶进行涨发加工，其中食品级NaOH涨发是最适合发制毛肚的方法[1]，经过处理后口感脆嫩化渣。目前，关于毛肚的研究主要集中在涨发过程中的不同工艺和条件优化等方面[2]，其中研究表明涨发温度对毛肚产品品质有很大影响，如碱处理毛肚在25 ℃可以获得最大增重比[3]，碳酸钠处理毛肚在43 ℃时获得最佳感官评价[4]，但是关于毛肚蛋白在涨发过程中的性质变化却鲜有报道。

蛋白质的结构和理化特性对肉制品品质有重要影响，而热处理温度等条件会改变蛋白结构从而影响蛋白质性能。研究表明，不同加工温度处理手段下蛋白的结构存在明显差异[5]，升高加工温度会导致鱼鳞胶原蛋白中无规则卷曲部分占比增大[6]；肌原纤维蛋白二级结构会随温度升高发生改变甚至变性和聚集[7]；升高温度时肌原纤维蛋白的表面疏水性则先增大后减小，蛋白质的变性程度逐渐加深[8]，是导致刺身蛋白结构变化的主要原因[9]。

毛肚富含胶原蛋白，因此胶原蛋白的结构特性对毛肚品质有重要影响[10]。盐渍处理对新鲜毛肚胶原蛋白结构具有显著影响[11]，但涨发条件尤其是涨发温度对毛肚胶原蛋白结构变化研究仍为空白。为进一步探究碱发温度对毛肚胶原蛋白的影响，本文选取毛肚为原料，采用NaOH碱发工艺，探究不同涨发温度对胶原蛋白结构的影响，以期为毛肚安全加工和批量生产提供理论依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄牛毛肚 购于重庆市南岸区水产批发市场，低温保藏运输至实验室后立即处理。置于−20 ℃贮藏备用，使用前于4 ℃的冰箱中解冻；氯化钠、盐酸、氢氧化钠、甲醇、冰醋酸 重庆市钛新化工有限公司；胃蛋白酶（1:10000） 范德生物科技有限公司；EDTA、二水磷酸二氢钠、溴酚蓝、四水酒石酸钾钠 上海源叶生物科技有限公司；五水硫酸铜Aladdin公司；甘氨酸 Macklin公司；乙二胺四乙酸Biosharp公司；叠氮化钠 成都市科龙化工试剂厂；以上皆为分析纯。尼罗蓝 Adamas公司；荧光白 上海阿拉丁试剂公司；Tris biotopped公司；溴酚蓝 coolaber公司；牛血清蛋白 Biofroxx公司；SDSPAGE凝胶制备试剂盒 北京索来宝科技有限公司；考马斯亮蓝R250 上海拓旸生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 涨发温度对毛肚胶原蛋白结构的影响 选取清洗处理后毛肚为原料，在料液比（w/v）为1:3.6，食品级NaOH溶液浓度为5 mg/mL，时间为30 min条件下，设置不同温度处理组（40、45、50、55、60 ℃），室温为未处理组，研究不同涨发温度对毛肚胶原蛋白结构的影响。

1.2.2 毛肚胶原蛋白的提取 参考曲文娟等[12−14]的做法，并略作修改。去除新鲜毛肚的表面异物后清洗干净。200 g毛肚切碎后按照1:10（w/v）的固液比添加0.1 mol/L氢氧化钠溶液，浸泡72 h除去色素和杂质蛋白。用超纯水洗至中性pH。按照1:10（w/v）的固液比添加10%的正丁醇溶液，浸泡48 h除去多余的脂肪，用超纯水清洗。按照1:10（w/v）的固液比添加含有胃蛋白酶（酶活力1:10000）的0.1 mol/L醋酸溶液，搅拌72 h。将滤液收集起来合并后用透析袋（分子截留量为8000～14000 kDa）透析脱盐24 h，真空冷冻干燥、封口包装，并将样品置于−20 ℃的冰箱中，供测定指标使用。将处理后的胶原溶液调节pH至7.0左右，透析、真空冷冻干燥。以上所有操作均在低温下进行。

1.2.3 紫外光谱的测定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同涨发温度处理后冻干的毛肚的胶原蛋白，制备成0.5 mg/mL胶原蛋白溶液，测量毛肚的胶原蛋白紫外吸收光谱（190～400 nm）。

1.2.4 红外光谱的测定 参考Noorzai等[15]的方法，略作修改。取1 mg经过冷冻干燥后的样品，加入100 mg KBr于研钵中研磨均匀，在500～4000 cm−1下扫描。利用测试软件对毛肚胶原蛋白的红外光谱进行自动基线校正、平滑、标准化处理后，导出原数据。再利用Peakfit 4.12处理，毛肚胶原蛋白酰胺I区（1600～1700 cm−1），依次进行相关基线校正、Gaussian去卷积、二阶导数拟合，分别分析毛肚的胶原蛋白二级结构组成的变化。

1.2.5 荧光光谱的测定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同涨发温度处理后冻干的毛肚的胶原蛋白，制备成0.5 mg/mL胶原蛋白溶液，测量毛肚的胶原蛋白荧光光谱（310～400 nm）。

1.2.6 表面疏水性的测定 采用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解制作不同加工温度处理组盐渍毛肚的1.0 mg/mL胶原蛋白溶液，取1 mL上述胶原溶液和200 μL 1.0 mg/mL溴酚蓝溶液加入离心管中，漩涡保持10 min，离心10 min（8000×g），取0.4 mL离心上清液，加入3.6 mL 0.1 mol/L醋酸溶液，振荡混匀，在595 nm处测定不同温度处理组胶原溶液的吸光值（A样品），同时使用0.1 mol/L醋酸溶液作为空白组（A空白）。胶原蛋白的表面疏水性采用如下公式计算：

1.2.7 巯基含量的测定 采用 Disimplicio[16]的方法，略作修改。使用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解不同涨发温度处理组的胶原蛋白，配制1.0 mg/mL的蛋白溶液。加入9.0 mL Tris-甘氨酸溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，pH8.0），离心15 min（10000×g），取4.5 mL上清液加0.5 mL Ellman试剂（4 mg 5,5'-二硫基双-2-硝基苯甲酸溶解于1.0 mL的Tris-甘氨酸缓冲液），振荡混匀后，25 ℃条件保持30 min，同时使用0.1 mol/L醋酸溶液作为对照组，在412 nm下测定吸光度。公式为：

式中：13600为摩尔消光系数（L·cm/mol），ρ表示胶原质量浓度（mg/mL）。

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1.2.8 扫描电镜分析 分别将冻干的毛肚胶原蛋白固定喷金，设置加速电压为10 V，使用扫描电镜观察毛肚的胶原蛋白微观结构。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010进行数据处理；采用SPSS 19.0统计分析软件进行方差分析和显著性检验；采用Origin 2018进行图像处理。所有试验均做3次重复测定，试验数据采用平均值±标准偏差形式表示。

2 结果与分析

2.1 毛肚胶原蛋白的紫外可见光谱分析

如图1所示，毛肚胶原蛋白在228 nm 处出现最大吸收波长，与报道一致[17−18]。不同温度处理组的毛肚胶原蛋白的吸光度强度均低于未处理组，且不同涨发温度毛肚胶原蛋白的吸光度不同。随着加工温度的升高，最大吸收峰强度先降低再升高后又降低，毛肚胶原蛋白280 nm附近最大吸收峰波长的变化趋势与230 nm波段保持一致。说明不同涨发温度使毛肚胶原骨架发生了明显变化，这是由于蛋白展开过程中一些疏水性残基通过加热产生三重螺旋[19]，胶原氨基酸的残基所处环境发生了改变。

图1 不同涨发温度处理毛肚胶原蛋白紫外可见光谱图Fig.1 UV absorbance spectrum of tripe collagen at different temperatures during the lye macerating

2.2 毛肚胶原蛋白的红外光谱分析

如图2及表1所示，酰胺A区与N-H的伸缩振动相关，当N-H参与生成氢键时其吸收峰发生蓝移[20]。与未处理组相比，处理组酰胺A区最大吸收波长红移。45 ℃处理组红移至3410.64 cm−1，明显高于其他各处理组。随着加工温度的升高，酰胺A区的最大吸收波长先红移后蓝移再红移，说明涨发处理会破坏毛肚胶原蛋白内部的氢键数量，且温度不同、破坏胶原蛋白内部氢键数量不一样[21]。酰胺I、II和III区的范围能够影响蛋白质的结构，酰胺I区与肽链内羰基（C=O）的拉伸振动相关，是研究蛋白质二级结构的重要区带[22]。与未处理组相比，处理组酰胺I区最大吸收波长蓝移。酰胺I区最大吸收波长随温度升高先升高后降低，与酰胺A区变化趋势相反，可能是由于升高涨发温度导致毛肚胶原蛋白内部的氢键平衡状态被破坏[23]。酰胺II区与C-N拉伸耦合及N-H伸缩振动相关，酰胺III区参与生成胶原蛋白的三螺旋结构，可以反映胶原蛋白特性[15]。

表1 不同涨发温度处理毛肚胶原蛋白的酰胺带峰位Table 1 The amide band peak of tripe collagen at different processing temperatures

图2 不同涨发温度处理毛肚胶原蛋白红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

采用Peakfit 4.12处理毛肚胶原蛋白酰胺I区（1600～1700 cm−1），依次进行相关基线校正、Gaussian去卷积、二阶导数拟合，得到不同涨发温度处理后的毛肚胶原蛋白分峰图谱。未处理组含有11个峰，不同温度处理组则含有10个峰，如图3所示。毛肚胶原蛋白二级结构组成的变化如图4所示。

图3 不同涨发温度处理毛肚胶原蛋白酰胺I带拟合图Fig.3 Fitting diagram of amide I band treated at different temperatures during the lye macerating

图4 不同涨发温度处理毛肚胶原蛋白二级结构组成Fig.4 Composition of secondary structure of tripe collagen treated with different temperatures during the lye macerating

由图4可知，不同涨发温度处理组β-折叠、α-螺旋、β-转角相对含量均高于未处理组（P<0.05），而无规则卷曲相对含量低于未处理组（P<0.05）。在胶原蛋白内部，β-折叠作为一种不稳定的中间产物，在外界条件影响下极易发生转变[24]。在升温初期（40→45 ℃），α-螺旋与β-折叠相对含量变化趋势相反，可能是由于毛肚胶原蛋白α-螺旋转变为β-折叠所导致的[25]。当涨发温度高于50 ℃时胶原蛋白由于亚基不断暴露，胶原蛋白结构松散，α-螺旋结构和无规则卷曲结构含量无明显变化。随着温度升高，β-折叠结构含量先升高后降低，β-转角结构含量先降低后升高，说明二者之间可能存在转化关系。研究表明，胶原蛋白的二级结构中，β-折叠和α-螺旋易被外界环境影响，一方面α-螺旋不断转变为β-折叠，另一方面亚基的降解会导致α-螺旋相对含量增加[26]；这与本研究得到的结果一致。

2.3 毛肚胶原蛋白的荧光光谱分析

由图5可知，与未处理组相比，不同温度处理组的最大发射波长随涨发温度的升高均发生红移，说明胶原蛋白发生变性导致部分芳香族氨基酸暴露在蛋白溶液中，极性逐渐增加[27]。随着温度的升高，由于胶原蛋白变性加剧，聚集程度加深掩盖了部分暴露在胶原溶液中疏水基团，毛肚胶原溶液表面疏水性降低，胶原溶液的极性减小[8]。随着温度的升高，不同温度处理组的荧光强度逐渐降低，说明胶原蛋白的变性过程中发生了不可逆转的聚集生成大胶原分子，减少了胶原溶液中疏水性氨基酸残基数量，致使荧光强度逐渐降低。

图5 不同涨发温度处理毛肚胶原蛋白荧光光谱图Fig.5 Fluorescence spectra of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

2.4 毛肚胶原蛋白表面疏水性分析

由图6可知，与未处理组相比，处理组的表面疏水性显著降低（P<0.05）。随着加工温度的升高，处理组表面疏水性先显著性升高再显著性降低（P<0.05）。这说明在升温过程中，胶原发生不可逆的变性，聚集程度较深，导致表面疏水性明显降低。此外，随着加工温度的升高，降低了维持胶原结构的作用力，二硫键、氢键、范德华力等作用力受到损害，胶原蛋白发生变性，胶原三级结构发生改变，疏水基团逐渐暴露在胶原溶液中，致使胶原溶液环境的表面疏水性不断升高[28]；当加工温度高于60 ℃时，因胶原蛋白的聚集程度加深掩盖了部分暴露在胶原溶液中疏水基团，毛肚胶原溶液表面疏水性显著降低（P<0.05）。

图6 不同涨发温度处理下胶原表面疏水性Fig.6 Collagen surface hydrophobicity at different temperatures during the lye macerating

2.5 毛肚胶原蛋白巯基含量分析

由图7可知，不同涨发温度处理组胶原溶液中巯基含量随温度升高逐渐增加（P<0.05），说明升温会导致毛肚胶原蛋白发生变性，胶原蛋白结构展开，暴露出更多巯基[29]。巯基是蛋白中活性最强的功能性基团，分布在蛋白表面的巯基易氧化生成稳定的二硫键，通过测定蛋白活性巯基和总巯基含量可以反映蛋白结构的变化及蛋白间的相互作用。

图7 不同涨发温度处理毛肚胶原蛋白巯基含量Fig.7 The content of sulfhydryl groups in tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

2.6 毛肚胶原蛋白的扫描电镜分析

不同涨发温度处理下毛肚胶原蛋白的扫描电镜图谱如图8所示。与未处理组相比，不同涨发温度处理组毛肚胶原微观结构发生明显变化，部分胶原由破碎的叶片状向球棒状结构转变，变性的胶原纤维向明胶结构转变，但基本保留了部分碎片状的胶原分子。随着涨发温度的升高，胶原分子开始收缩，逐渐卷曲，加快凝集，缝隙减小，片状胶原破碎。其中，55 ℃和60 ℃处理组叶片状胶原破碎效果明显，并且球棒状胶原开始断裂，胶原聚集程度加深，胶原发生不可逆转变性。

图8 不同涨发温度处理毛肚胶原蛋白扫描电镜图Fig.8 Scanning electron microscopy of tripe collagen treated at different temperatures during the lye macerating

3 结论

本文研究不同温度（40～60 ℃）的NaOH涨发对毛肚胶原蛋白结构的影响，发现NaOH涨发处理会导致毛肚胶原蛋白最大吸收波长发生明显偏移，二级结构被破坏，胶原蛋白与其他分子的相互作用力（如氢键、疏水相互作用力等）发生改变。NaOH碱发处理对胶原蛋白微观结构的影响显著，胶原分子随温度升高开始收缩并逐渐卷曲，缝隙减小，片状胶原破碎。当温度达到50 ℃时球棒状胶原开始断裂，胶原聚集程度加深，胶原发生不可逆转变性。在今后的研究中可以进一步探究NaOH碱发浓度、时间以及各种酶法处理对毛肚胶原蛋白结构和功能特性的影响，为毛肚加工品质形成机理和工业化生产提供理论支持。