中药对16SrRNA甲基化酶耐药性研究

文│王书敏（江苏省泗阳县畜牧兽医站）

随着抗菌药物的广泛使用，临床耐药现象日趋严重。据报道，我国临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位，耐药菌继发感染人数已占住院感染患者总人数的30%左右。令人担忧的是，开发一种新的抗菌药一般需要大约10年的时间，而近几年一代耐药菌株的产生只需要2年时间，细菌耐药性的增长速度远远超过新药研发速度。目前能与细菌感染对抗的抗菌药数量不断减少、活性不断减弱，如任其发展，人类将面临随之而来的“后抗生素时代”，即对细菌性感染束手无策的黑暗时代。因此，开发抗耐药性药物引起了包括欧美在内越来越多国家的重视。

近年来，有望作为抗生素替代品之一的中药研究取得了一定的进展。如宓伟等研究表明，中药黄连、黄柏、大黄、银柴胡和石榴皮水煎液具有较强的抗菌作用。冷会勇等认为，中药用于临床多重耐药鲍曼不动杆菌的治疗具有一定的开发价值和应用前景。其他研究表明，中药能降低耐药菌所产β-内酰胺酶的活性，使其部分或全部恢复对抗生素的敏感性，延长抗生素的使用寿命。

16S rRNA甲基化酶是临床菌产生的一种介导4，6-二脱氧链霉胺类氨基糖苷抗生素耐药的耐药决定因子。该耐药决定因子的遗传背景中含有质粒、转座子、整合子、插入序列等可动遗传因子，因此，在临床耐药菌中具有广泛传播的能力。本研究以构建的16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌及10种中药免煎颗粒为研究对象，研究10种中药免煎颗粒对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的影响，以期为临床开发抗菌新药及新制剂奠定基础。

一、材料和方法

1.材料。

（1）菌株。16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌、质控菌E.coli ATCC 25922，购自中国食品药品检定研究院。

（2）培养基。水解酪蛋白肉汤（MH Broth）、水解酪蛋白琼脂（MH agar），购自杭州天和微生物试剂有限公司。红四氮唑购自扬州科能生物技术有限公司。

（3）主要仪器设备。

（4）供试药物。

2.方法。

（1）受试药液的制备及稀释。称取受试中药颗粒，分别用灭菌超纯水溶解成表1的药物浓度，针头滤器过滤后分装，于-20℃或-70℃冷冻保存备用。

表1 药物贮备液配制浓度表

（2）菌液制备。在MH琼脂平板上挑取单个菌落接种于2～5毫升Muller-Hinton（MH）肉汤管中，37℃振荡培养4～8小时，用调节过钙镁离子的MH肉汤稀释菌液，使稀释菌液达到0.5麦氏比浊管浊度，再按1∶100稀释菌液至含菌量约为1×106CFU/毫升，备用。

（3）MICs测定。首先向96孔微量细胞培养板各孔中加入稀释好的菌液（1×106CFU，毫升）100微升，再向第一排孔中加入稀释好的药液100微升，混合均匀。取第一排的混合液100微升至第二排，混合均匀后依次稀释至最后一排，弃去最后的100微升。稀释菌液于15分钟内接种完毕。37℃培养16～18小时，每次做3个重复，同时设定3个对照组，分别为质控菌组（大肠杆菌ATCCR25922），只加菌液不加药物组，不加药液和菌液组。

（4）结果判定标准。观察结果2小时前，向每个细胞培养板的孔内加入0.5%的红四氮唑溶液5微升，37℃继续培养2小时，观察试验结果。

电子天平images/BZ_48_933_2092_2268_2135.pngimages/BZ_48_933_2184_2268_2227.pngimages/BZ_48_933_2275_2268_2318.png上海精密科学仪器有限公司净化工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司全自动高压蒸汽灭菌器毫升S-3020（2-09-1032） 日本

当只加菌液不加药物时细菌明显生长，呈现红色，不加药液和菌液的对照组无细菌生长，呈现无色，试验组小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为MIC值（小孔呈现无色）。当出现单一跳孔，记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如出现多孔跳孔现象，则不记录结果，重新试验。

二、结果

由表2可知，10种中药免煎颗粒对16S rRNA甲基化酶耐药重组菌的最低抑菌浓度分别为20（黄连）、80（黄芩）、80（黄柏）、320（苦参）、320（穿心莲）、80（连翘）、1280（白头翁）、160（蒲公英）、10（五倍子）、80（乌梅）毫克/毫升。

表2 10种中药对16SrRNA甲基化酶耐药大肠杆菌的体外抑菌活性

images/BZ_49_213_508_1547_551.png黄柏颗粒 2014-12-5 1412017 6 江阴天江药业有限公司images/BZ_49_213_599_1547_642.png蒲公英颗粒 2015-1-20 1501053 15 江阴天江药业有限公司images/BZ_49_213_691_1547_734.png乌梅颗粒 2014-12-16 1412062 10 江阴天江药业有限公司images/BZ_49_213_782_1547_825.png黄芩炭颗粒 2013-3-5 1303143 10 江阴天江药业有限公司images/BZ_49_213_874_1547_917.png五倍子颗粒 2014-8-20 1408125 3 江阴天江药业有限公司images/BZ_49_213_966_1547_1008.png

三、分析与讨论

中药免煎颗粒是在中药饮片基础上发展起来的一种中药新剂型，它具有给药剂量较准确、药效稳定、药量易于控制等优点。因此，在临床应用上存在广阔的发展空间。本研究结果表明，10种中药免煎颗粒对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的体外抑菌作用各不相同。其中以黄连、五倍子对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的体外抑菌最强，有望成为抗耐药菌感染的药源。

五倍子（Galla chinensis）具有敛肺降火、涩肠止泻、敛汗止血、收湿敛疮等功效。现代药理研究表明，五倍子具有抗菌、抗病毒、清除自由基等作用，在临床上配合其他药物治疗腹泻、口腔溃疡、肾囊肿等疾病，获得了较好的疗效。李仲兴等研究结果表明，五倍子水煎剂的MIC为0.102毫克/毫升，低于本研究中五倍子对16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的MIC值（10毫克/毫升）。同时，李仲兴等研究表明五倍子对甲氧西林金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林表皮葡萄球菌的MIC50分别为0.051毫克/毫升，高于本研究结果。

黄连（Coptidis rhizoma）有清热燥湿、泻火解毒的功效，现代研究表明，黄连的有效成分具有抗菌、抗病毒、抗真菌和抗寄生虫等药理作用。谭榀新等研究表明黄连提取物对耐药金黄色葡萄球菌的耐药蛋白质图谱发生改变。张景皓等研究表明，不同浓度的黄连溶液对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌未呈现抑菌活性，对D群屎肠球菌、大肠杆菌的MIC均为0.063克/毫升。本研究中，黄连对16SrRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的MIC为20毫克/毫升，高于黄连水煎液对D群屎肠球菌、大肠杆菌的MIC。

中药不但可直接影响细菌的生长和繁殖，还可通过抑制细菌呼吸、糖及其中间产物及核酸、蛋白质的代谢达到抑菌作用。另外，中药可通过增强细胞免疫功能而达到清除细菌的作用。本课题组通过初步研究表明，中药五倍子、黄连、黄芩对耐药菌有一定的抑菌作用，而这些药物通过哪种机制发挥作用，将有待于做进一步的研究和探索。

四、结论

中药黄连、五倍子对16SrRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌有较强的抑制作用，表明这两种中药对16S rRNA甲基化酶多重耐药菌感染的治疗具有一定的开发价值和应用前景。