枯草芽孢杆菌固态发酵虾头制剂对小鼠生长与肠道菌群影响研究

潘朝阳，王永臻，黄文灿，刘振，黄海燕，孙建安，毛相朝

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

虾作为海洋牧场中的海珍品之一，营养丰富、滋味鲜美，广受消费者欢迎[1]。2020年我国虾产量约631万吨，虾加工和食用过程会产生大量的虾头、虾壳等副产物，约占原料的45%～70%。这些虾加工副产物富含甲壳素、蛋白质、磷脂和虾青素等营养物质，虾头与虾壳相比，其蛋白质、游离氨基酸、脂肪和游离脂肪酸含量较高，而灰分、甲壳素含量较低[2]，因此虾头是虾加工副产物中最具营养价值的一部分，但其中甲壳素、蛋白质、钙质和脂质等成分结合紧密并且含盐量高，直接作为饲料动物难以充分吸收利用[3]，只有小部分被干燥后才可作为低质饲料使用，而大部分被直接丢弃。虾副产物的直接丢弃不但造成大量的资源浪费，还会造成严重的环境污染隐患。因此虾副产物的高值化利用，是充分开发虾类资源，实现我国虾产业绿色健康发展的重要研究方向。

固态发酵是一种将固态基质中的营养物质加以利用的发酵转化手段，非常适合应用于对虾副产物的高值化加工，同时枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，能产生耐干燥、耐热、抗紫外线和有机溶剂的孢子，具有很强的环境适应能力[4]，并且列于我国农业部颁发的《饲料添加剂品种目录（2013）》中[5]，可在动物饲料中使用。枯草芽孢杆菌无致病性，且具有广谱的对抗病原体的活性，可以分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等多种酶类，在发酵过程中可对虾头中的蛋白质、脂质等成分进行高效水解，有助于其营养物质的释放和被利用。同时，枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂使用时，还可发挥肠道定植、与其他微生物竞争排斥、特定代谢物的产生和免疫系统的刺激等功能活性[6]。

有调查显示[7]，我国宠物行业市场规模近3 000亿，消费热点聚焦在宠物饲料与用品上。而宠物饲料不同于传统饲料注重转化率和料肉比，其更注重适口性、风味、营养均衡和高消化率。宠物市场的消费者在饲喂宠物时往往缺乏对宠物饲料营养均衡的正确理解，容易盲目地进行自由搭配，额外为宠物提供能量棒、肉罐头等食物，导致宠物出现消化不良或营养过剩等问题[8]。同时市场上绿色天然、营养均衡、适口性好的宠物饲料添加剂较少，而通过益生菌固态发酵虾头，既可以利用虾头中丰富的营养，又能够同时发挥益生菌的功效，可作为一种绿色天然的宠物饲料添加剂使用。

基于以上虾产业发展和宠物饲料添加剂市场需求，本研究以虾头为主要原料，通过枯草芽孢杆菌进行固态发酵转化，并将发酵产物进行小鼠饲喂实验，探究其对小鼠生长性能和肠道菌群的影响来验证枯草芽孢杆菌固态发酵虾头制剂产品的饲喂效果，为其在宠物饲料添加剂中的应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌OKF-004：中国海洋大学食品学院海洋食品酶学与生化工程实验室筛选保存，筛选自中国东海深海淤泥并能以南极磷虾粉为唯一碳氮源生长。南美白对虾头和麸皮：青岛盛隆伟业科技有限公司；可溶性淀粉（食品级）：上海沪试国药集团；小鼠AIN-93M标准维持饲料（由酪蛋白、蛋氨酸、玉米淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖、纤维素、大豆油、碳酸钙、磷酸二氢钾、重酒石酸胆碱等组成）：济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 仪器与设备

生物安全柜（HFsafe-1200LCA2）：上海力新学仪器有限公司；高压灭菌锅（GI80TW）：致微（厦门）仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9075A）：上海树立仪器仪表有限公司；生化培养箱（SPX 270）：宁波市科技园区新江南仪器有限公司；高通量测序仪（NovaSeq 6000）：illumina（中国）公司。

1.3 实验动物

30只SPF级BALB/c小鼠，日龄4周～6周，体重（17±2）g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK（鲁）20190003。

1.4 方法

1.4.1 发酵虾头制剂制备

将南美白对虾头和麸皮按质量比7∶5混合得到固体基质，加水至60%含水量。固体基质按质量分数5%接种活菌数为109CFU/mL的枯草芽孢杆菌，然后在30℃的摇瓶中发酵48 h。发酵后在基质中添加0.5%的干燥保护剂可溶性淀粉，混匀后50℃鼓风干燥6 h，得到符合国家农业部标准NY/T 2131—2012《饲料添加剂枯草芽孢杆菌》的固态枯草芽孢杆菌发酵虾头制剂，活菌数＞109CFU/g。

1.4.2 动物分组与处理

实验BALB/c小鼠先用维持饲料饲养8 d以适应环境，8 d后将BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只，分别为正常对照组（NC）、添加未发酵虾头对照组（MC）和添加发酵虾头制剂干预组（MH）。每组实验BALB/c小鼠分为两笼饲养。未发酵虾头和发酵虾头制剂添加量为维持饲料质量的0.1%。鼠房温度控制在（24±2）℃，湿度（45±5）%，每隔4 d更换一次垫料。

1.4.3 小鼠体重变化、采食量测定

实验期间每天中午称取每只小鼠的体重和每笼小鼠食槽内剩余的饲料量并记录。将剩余饲料丢弃，重新添加对应实验分组饲料50 g。

1.4.4 小鼠体脂率、胸腺和脾脏指数测定

实验第8周脱颈椎处死小鼠后，随机选取每组每笼4只小鼠解剖，称取肾周脂肪、睾周脂肪、胸腺和脾脏质量，体脂率和脏器指数计算公式如下。

1.4.5 生物学信息分析

实验期间按照分组进行饲喂，每2周收集每组小鼠粪便混样，共收集 3 次（依次记为 W1、W2、W3）；第8周脱颈椎处死全部小鼠，按实验分组收集肠道内容物混样，样品（记为W4）进行16S rDNA扩增子高通量测序，测序平台为Illumina NovaSeq，测序策略为双端测序PE250，测序区域为16SV4，上下游引物分别为515F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，对 Illumina NovaSeq测序得到的原始数据进行筛选和嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据。为研究各样本的物种组成，对所有样本的有效数据，以97%的一致性进行可操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）聚类和物种分类分析、菌群多样性（物种总数、香农指数及辛普森指数）分析及多样本比较分析，以得到全面准确的肠道微生物群落结构组成。

1.5 数据处理与分析

实验数据处理采用统计学软件SPSS 25.0进行分析，采用单因素方差统计学分析（One-Way ANOVA）进行数据的统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。对微生物多样性Alpha指数（物种总数、香农指数及辛普森指数）用物种累积箱形图和wilcox秩和检验来评估各样本中微生物群落的物种丰富度及多样性的差异。对多样本比较分析采用无度量多维标定法（nonmetric multi-dimensional scaling，NMDS）来评估个样本间组内与组间差异。

2 结果与分析

2.1 不同饲喂条件对小鼠体重、采食量和体脂率的影响

实验期间不同饲喂条件下小鼠体重、采食量和体脂率的变化分别见图1。

图1 各实验组小鼠体重、采食量、体脂率的变化Fig.1 Body weight change，feed intake，body fat percentage of mice in each experimental group

由图1A可知，各实验组间小鼠体重无明显差异。由图1B可知，自14 d后未发酵虾头对照组（MC）和发酵虾头制剂干预组（MH）的小鼠采食量逐渐高于对照组（NC）小鼠，而MC与MH组并无明显差异。冯建等[9]研究表明在南美白对虾植物蛋白日粮中添加2%由虾头酶解得到的虾肽可以明显提高诱食性，提高南美白对虾成活率。冷向军等[10]研究表明虾蛄水解蛋白浆对异育银鲫具有显著的诱食作用。说明虾头对小鼠有一定的诱食效果，其原因可能是虾头中的风味蛋白与核苷酸等物质促进了小鼠的采食。由图1C可知，MH组体脂率显著低于MC组（P＜0.05），饲喂枯草芽孢杆菌发酵的虾头组（MH）小鼠比饲喂虾头组（MC）的小鼠体脂率下降了约62.9%，而NC组与MC组、MH组均无显著性差异（P＞0.05）。刘玉芝等[11]对高血脂、肥胖小鼠饲喂枯草芽孢杆菌JS01，研究脂质代谢与肠道菌群的影响，发现枯草芽孢杆菌有降脂功能，主要是通过影响肠道菌群尤其是乳酸菌的生长繁殖来间接促进脂肪代谢和分泌各种酶类和非酶类代谢产物来降脂。虾头中脂肪含量高达20%[12]，脂肪含量高不但容易腐败，而且用于动物饲喂可能引起高血脂、瘦肉率降低等影响品质的问题。而通过对虾头固态发酵，不但可以通过枯草芽孢杆菌分泌的脂肪酶对虾头脂肪进行分解，而且还可以通过肠道定植进一步影响肠道菌群促进脂肪的代谢，从而降低虾头脂肪含量高的负面影响，在充分发挥虾头营养成分丰富优势的前提下，同时有效控制动物的体脂率。

2.2 不同饲喂条件对小鼠胸腺和脾脏指数的影响

实验期间不同饲喂条件下小鼠胸腺和脾脏的变化分别见图2。

图2 各实验组小鼠胸腺指数、脾脏指数Fig.2 Thymus index and spleen index of mice in each experimental group

胸腺和脾脏是机体的重要淋巴器官，其功能与免疫紧密相关，测定脏器指数可以直观反映各实验组小鼠免疫能力的强弱[13]。由图2可知，胸腺指数在各组之间无显著性差异（P＞0.05）；MH组与NC组小鼠的脾脏指数具有显著性差异（P＜0.05），饲喂发酵虾头制剂组（MH）小鼠的脾脏指数比空白对照组（NC）提升了35.7%，说明发酵虾头制剂有提高脾脏指数的作用。枯草芽孢杆菌对提升免疫能力已被广泛证明，陈俊宏等[13]对AA鸡日粮添加1010CFU/g枯草芽孢杆菌、郭瑞萍等[14]在AA肉鸡日粮中额外添加1011CFU/kg的枯草芽孢杆菌，实验对象脏器指数均显著提高。

2.3 各实验组小鼠肠道菌群OTUs统计及物种注释分析

通过以上不同饲喂条件小鼠生长和免疫指标的实验结果可知枯草芽孢杆菌发酵虾头制剂具有降低小鼠体脂和提高小鼠免疫力的效果。为探讨这一效果的影响机理，本研究从肠道菌群变化方面进行了进一步研究。

2.3.1 微生物多样性Alpha分析

首先对微生物多样性Alpha指数（物种总数、香农指数及辛普森指数）进行统计分析，用于分析不同饲喂条件下每组小鼠组内的微生物群落多样性与丰度，即不同实验组小鼠肠道菌群的种群数量。物种总数为直观观测到的物种数目，反映了肠道菌群的丰富度，而香农指数和辛普森指数为同时考虑肠道菌群的丰富度与均匀度的指数，其中辛普森指数主要反映了肠道菌群的均匀度。不同时期不同实验组小鼠肠道菌群的物种总数、香农指数和辛普森指数见图3。

图3 各实验组小鼠物种总数、香农指数和辛普森指数Fig.3 Observed species，Shannon，Simpson parameter of each experimental group

图3A直观反映OTUs的指标物种总数，其数值越大，代表样品中OTUs数越高即样品中检测到的序列越多，样品中细菌的丰富度越高。按照时间横向对比，W1、W3和W4各实验组物种总数无显著性差异（P＞0.05），MH-W2组物种总数显著低于NC-W2组（P＜0.05），而 MC-W2 组与 MH-W2、NC-W2组均无显著性差异（P＞0.05）。按照时间纵向对比，NC组从W1到W2，W3到W4有显著增加；MC组只在W3到W4有显著性增加；而MH组则一直呈现增加的趋势。群落多样性越丰富，物种分布越均匀，香农指数与辛普森指数越大。由图3B可知，按照时间横向对比，MH-W1组香农指数显著低于 NC-W1组（P＜0.05）；W2、W3和W4各实验组香农指数均无显著性差异（P＞0.05）。按照时间纵向对比，NC组香农指数在实验期间保持平稳，代表其肠道菌群的多样性和均匀度相对稳定；MC、MH组香农指数从W1到W2持续增长，后续实验期间无显著性变化（P＞0.05）。由图3C可知，MH-W1组辛普森指数显著低于NC-W1组（P＜0.05），其余各时期各组无显著差异（P＞0.05）。

结合生物丰度指数物种总数与多样性香农、辛普森指数，可以发现维持饲料中添加未发酵虾头MC组和发酵虾头制剂MH组在实验期间相对于维持饲料的对照组NC，小鼠肠道菌群总体的多样性和丰度没有显著性提升，W3、W4时不同实验组小鼠肠道菌群的多样性和丰度也没有显著性差异，证明维持饲料中添加未发酵的虾头和发酵虾头制剂不会破坏小鼠肠道菌群整体的多样性和丰度。

2.3.2 物种聚类分析

在了解各实验组菌群的多样性和丰度情况后，对各实验组中不同菌群的相对丰度进行聚类注释，进一步探究肠道菌群内不同菌群的占比。种水平上各实验组不同时期相对丰度前10的物种柱形图见图4。

图4 种水平上的物种相对丰度的柱形图Fig.4 Histogram of relative abundance of species at different levels

由图4可知，相对丰度前5的菌种分别为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）、产酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens）和鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）。

罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是国际上公认的黏附性强、改善肠道环境，拮抗有害菌定植，避免肠道疾病的益生乳酸菌[15]，也是我国2010年卫健委批准的可用于食品的菌种。木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）是革兰阳性杆菌，弱致病性的凝固酶阴性葡糖球菌的一种，主要存在于肉的腌制过程中的一种腐败菌[16]，还有研究表明该菌会引起奶牛乳腺炎[17]。约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）同样为我国2010年卫健委批准的可用于食品的菌种。其功能主要为抑菌[18]、抗炎[19]、提高脏器指数[20]和改善肠道环境[21]。约氏乳杆菌亚型PM308还有改善肥胖体质、降低体脂肪及减少胆固醇的用途，同时约氏乳杆菌还广泛存在于抗过敏益生菌当中。产酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens）作为肠道拟杆菌属的一种，主要的功能是可化能有机营养，产生机体所需的营养和能量。有研究证明Bacteroides acidifaciens促进脂肪代谢[22]、治疗糖尿病和肥胖[23]和改善人类患者的放疗反应[24]。鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）是一种潜在益生菌，具有抗肠道炎症[25]和防治迟发性败血症的效果[26]。

由图4可知，除了MH-W3组的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）丰度与MC-W3组基本相等，MH组罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）和约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）这两种益生菌丰度均高于MC组；NC组约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）仅在W1时高于MC组，NC组罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）仅在W4高于MC组；而弱致病性的木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）仅在NC-W4组中富集；鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）在 NC-W1、W2和 W4组有明显的富集，可能是小鼠肠道有炎症导致该菌丰度上升[27]。

通过物种聚类分析，研究发现添加枯草芽孢杆菌发酵虾头MH组对肠道乳酸菌等有益微生物有明显增殖作用，对于优化肠道菌群构成，维持肠道环境有积极的意义，这与周梦佳等[28]和赵力等[29]研究结果相似。而添加未发酵虾头MC组对肠道菌群的益生效果虽然不如MH组，但相较于维持饲料NC组还是有一定的益生作用，表明虾头丰富的营养物质有利于小鼠肠道的健康。NC-W4对照组小鼠肠道木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus） 和鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）相对丰度提高，推测可能患有轻微的肠道炎症，进一步说明了虾头原料和枯草芽孢杆菌虾头发酵制剂在抑制肠道有害菌群方面的作用，其中枯草芽孢杆菌发酵虾头制剂效果更为明显。

2.3.3 多样本比较分析

不同时期不同实验组NMDS分析见图5。

图5 各实验组NMDS分析Fig.5 NMDS analysis of each experimental group

多样本比较分析通过NMDS来表明各实验组之间的菌群的差异性，体现菌群分析结果的可信性，根据样本中包含的菌群物种信息，通过点与点间的距离体现组间和组内差异，通常Stress值小于0.2时，说明NMDS可以准确反映样本间的差异程度。图5展示了基于OTUs水平的NMDS分析结果，不同点表示不同时期各实验组小鼠肠道菌群，同时期相同实验处理组的点之间的距离远近反映了小鼠肠道菌群样品的重复性强弱，不同圈之间的距离反映不同时期不同处理下小鼠肠道菌群的差异大小。Stress值为0.135，说明该NMDS分析可以反映不同时期各实验组小鼠肠道菌群的差异性，随着实验的进行各实验组W1、W2、W3、W4时小鼠肠道菌群差异明显，而同一时期下各实验组也有所差异。该NMDS分析直观表现了不同时期饲喂未发酵虾头与枯草芽孢杆菌发酵虾头制剂对小鼠肠道菌群的差异性。

3 结论

研究结果表明，在小鼠标准维持日粮中额外添加0.1%枯草芽孢杆菌发酵虾头制剂与额外添加0.1%虾头组的小鼠相比，可显著降低饲喂小鼠的体脂率62.9%，与饲喂维持日粮相比可提升小鼠的脾脏指数35.7%，同时小鼠肠道中罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）等有益微生物相对丰度增加。枯草芽孢杆菌发酵虾头制剂具有降低体脂、提高免疫力和维持肠道益生菌群平衡的效果，具有在高端宠物饲料添加剂领域的应用潜力。本研究对提升虾头的使用价值，促进虾加工副产物的高值化加工利用具有一定的借鉴意义。