利健文,谢春生,韦寿莲
(1.广东食品药品职业学院中药学院,广州 510520; 2. 肇庆学院,广东肇庆 526061)
杜香为被子植物杜鹃花科杜香属常绿灌木,主要分布于大﹑小兴安岭和吉林长白山,是中国传统中药材,也是重要的香料植物。杜香以其挥发油入药,主治化痰,止咳,平喘,兼有降压﹑杀菌止痒﹑抗氧化等作用。杜香挥发油的提取方法及其成分分析鉴定一直是杜香的研究热点[1–4],目前主要的提取方法有CO2超临界流提取(SFE)[5–6]﹑有机溶剂浸提[7,8]﹑超声波辅助乙醇提取[9]﹑水蒸气蒸馏(SD)[10–12]﹑复合溶剂水热法[13]等。传统提取方法存在或提取工艺时间长﹑效率低﹑耗能高﹑仪器复杂昂贵成本高等问题。
笔者分别采用微波辅助水蒸气蒸馏法和水蒸汽蒸馏提取杜香挥发油,采用毛细管气相色谱–质谱联用方法分析鉴定了其化学成分,并比较了两种方法所得挥发油化学成分及物性,找出了提取时间短﹑效率高﹑耗能少﹑成本低,更加绿色安全的更合理的微波辅助水蒸气蒸馏法(MAE–SD)取杜香挥发油提取工艺,为更好地开发利用杜香资源提供参考。
气相色谱–质谱联用仪:GCMS–QP2010 型,日本岛津公司。
微波炉:Galanz wp800 型,顺德格兰仕微波炉有限公司。
电子调温电热套:98–1–B 型,重庆市吉祥教学设备有限公司。
托盘天平:JYT–5 型,常熟市佳衡天平仪器有限公司。
挥发油提取器:B–034812 型,实验室组装,上海垒固仪器有限公司。
杜香:采自内蒙古大兴安岭,由广东食品药品职业学院汪小根教授鉴定。
实验所用试剂均为分析纯。
1.2.1 水蒸气蒸馏法
按2015 版《中国药典》提取植物精油的方法,分别称取一定量的样品于挥发油提取器中,加水蒸馏3 h,无水硫酸钠干燥,收集挥发油。
1.2.2 微波辅助水蒸气蒸馏法
样品经粉碎过0.180 mm 孔径筛,称取一定量置于挥发油提取器中,按照比例加入蒸馏水,置于顶端开口的微波炉中,设定微波功率480 W﹑时间30 min﹑杜香–水质量比为1∶9 进行微波辅助水蒸气蒸馏,收集挥发油,用无水硫酸钠干燥。
(1)气相色谱条件。色谱柱:RTX–5 石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm,美国Restek 公司);升温程序:初始温度为80 ℃,以10 ℃/min 升温到280 ℃;汽化室温度:250 ℃;载气:高纯氦气;载气流量:0.94 mL/min;进样体积:1.0 μL。
(2)质谱条件。电离方式为EI;灯丝电流:0.6 mA;电子能量:70 eV;倍增器电压:1.0 kV;离子源温度:200 ℃;质量扫描范围:m/z40~350;扫描周期:0.5 s;溶剂延迟:3 min。
经查阅文献及考察最终确定定性与定量分析条件如下[14–15]。
定性分析:分别取1.0 μL 挥发油,用气相色谱–质谱–计算机联用仪进行分析鉴定。通过NIST’02 谱库自动检索获得初步鉴定结果。根据所得质谱图与EPA/NIH 以及有关文献[7,9–10,12]对照,再结合人工谱图解析,以确认挥发油中各化学成分。
定量分析:通过Shimadzu GC–MS solution 数据处理系统,按照峰面积归一法进行定量分析,求出挥发油中各化学成分的相对质量分数。
试验发现通过微调升温程序,在初始温度80℃,以10 ℃/min 升温到280 ℃,样品中各色谱峰可达到良好分离,这可能是因为RTX–5 是弱极性柱,对香精油类有机化合物的分离具有高的选择性,加上毛细管柱的柱效高的缘故。因此色谱升温程序选择初始温度80 ℃,以10 ℃/min 升温到280 ℃。
在微波萃取工艺中,影响挥发油得率的因素主要有微波功率﹑提取时间﹑杜香–水质量比。因此以微波功率﹑提取时间和杜香–水质量比为考察因素,以得油率为考察指标。根据表1 正交设计方法,采用L9(34)正交试验设计优化微波辅助萃取的条件,正交试验设计见表2,正交试验结果见表3。
表1 因素水平表
表2 L9(34)正交试验设计表
表3 L9(34)正交试验结果
由表3 可见,微波功率﹑萃取时间﹑杜香–水质量比三因素的极差分别为2﹑0.3﹑1.1,表明微波功率对挥发油提取率的影响最显著,萃取时间对微波辅助提取挥发油萃取率影响较小。根据K值试验结果可见,A:K3>K1>K2;B:K2>K1>K3;C:K3>K2>K1,因此挥发油的最佳组合萃取条件为A3﹑B2﹑C3,即微波功率为480 W﹑时间为30 min﹑杜香–水质量比为1∶9。根据优化条件进行提取,得油率为2.1%。
2.3.1 得油率和物性的比较
水蒸气蒸馏提取按实验1.2.1 方法进行,微波辅助水蒸气蒸馏提取按1.2.2 进行,不同提取方法挥发油的产率和物性见表4。结果表明,微波辅助提取30 min 的得油率显著高于水蒸气蒸馏法3 h 的得油率,微波辅助提取所得挥发油的颜色也较SD 法的浅。由此可见,采用微波辅助提取不仅可以快速提取杜香挥发油,而且可以提高挥发油的得油率并保证其物性不受影响。
表4 不同提取方法提取挥发油的提取率和理化性质
2.3.2 挥发油的GC–MS 分析
采用GC–MS 分析不同提取方法所得挥发油。挥发油的总离子流图如图1﹑图2 所示。经检索NIST’02 质谱库﹑参考相关文献及根据各组分的特征性碎片离子进行质谱解析,相似度在90%以上的化合物及其相对质量分数见表5。
表5 不同提取方法提取杜香挥发油的化学成分及相对含量
图1 水蒸气蒸馏法所得杜香挥发油的总离子流色谱图
图2 微波辅助水蒸气蒸馏法所得杜香挥发油的总离子流色谱图
(1)由表5 可知,两种不同的提取方法所得样品总共有50 种成分,其主要成分为单萜﹑倍半萜及其氧化物。水蒸气蒸馏所得的杜香挥发油中鉴定出34 种化合物;微波辅助水蒸气提取所得挥发油种鉴定出33 种化合物。用面积归一法测定了两种样品各成分的相对百分含量,各占总峰面积的96.57%﹑95.43%。
(2)表6﹑表7 为两种不同提取方法所得杜香挥发油的主要成分。两种不同提取方法所得杜香挥发油的成分存在差异,其中β-水芹烯(beta-Phellandrene)﹑γ-松油烯(gamma.–Terpinen)﹑1-甲基-异丙基苯(1-methyl-2–(1-methylethyl)–Benzene)﹑异松油烯(terpinolene)﹑1- 萜品-4 醇(1–Terpinen-4-ol)﹑α- 侧柏醛alpha-thujena﹑松油醇(p-Menth-1-en-8-ol)﹑乙酸龙脑酯(bornyl acetate)﹑水芹醛(phellandral)﹑桃金娘烯醇(myrtenol)等17 种化合物为两种挥发油样品所共有。
表6 SD 提取杜香挥发油的主要成分
表7 MAE–SD 提取杜香挥发油的主要成分
(3)由表6 和表7 可见,两种不同提取方法所得杜香挥发油的主要成分不尽相同,但其中1-甲基-异丙基苯(1-methyl-2-(1-methylethyl)–Benzene)﹑1- 萜品-4 醇(1-Terpinen-4-ol)﹑α- 侧柏醛(alphathujena)在两种挥发油中都有较高的比例,是杜香挥发油香气的主要成分。
(4)作为我国的传统中药材杜香拥有诸多生理作用。比如,含量较多的α-侧柏醛具有镇咳﹑祛痰﹑平喘﹑镇静,同时还具有抑菌等作用;4-萜品醇具有显著的平喘作用;α-松油醇既有杀菌效果,又是良好的天然香料;α-蒎烯具有明显的祛痰﹑镇咳作用,同时还有抗真菌﹑驱虫作用。由此可见,杜香挥发油含有的主要成分不但可作为重要的香料成分,也是其杀虫﹑抗菌﹑平喘等作用的重要物质基础。
(1)通过正交试验研究确定了各因素对杜香油提取率的影响顺序:微波功率>杜香–水质量比>提取时间。最优条件为微波中低火,时间30 min,杜香–水质量比为1∶9。
(2)在微波辅助水蒸气提取杜香挥发油实验中,微波功率的大小对提取时间﹑出油率有影响,而对挥发油成分影响较小。
(3)与传统水蒸气蒸馏法相比,微波辅助提取法具有设备简单﹑适用范围广﹑萃取效率高﹑重现性好﹑节省时间﹑节省试剂﹑污染小等特点,可用于提取各类新鲜香料植物的挥发油。