欧李(Cerasus humilis)内生固氮细菌筛选、鉴定及特性研究

白 洁， 姚 拓*， 雷 杨， 王占军， 王辛有， 苑力晖

(1.甘肃农业大学草业学院， 甘肃 兰州 730070； 2.宁夏农林科学院荒漠化治理研究所， 宁夏回族自治区 银川 750000；3.兰州植物园， 甘肃 兰州 730070)

欧李(Cerasushumilis)是一种生长于我国北方荒漠草原、沙地边缘的矮灌木。具有抗寒、抗旱，再生能力强的特点。由于欧李成丛快、覆盖率高、根系发达，常被选做生态脆弱区的恢复树种[1]。王鹏飞等[2]研究发现，栽植欧李对黄土丘陵沟壑区灌下土壤理化性质有不同程度改善。此外，欧李枝叶质地柔软，含有丰富的钙、糖和蛋白质等营养物质，是牛羊所喜食的优质饲料[3]。基于此，欧李对缓解生态建设和畜牧业可持续发展之间的矛盾具有重要意义[4]。

欧李经过长期的自然选择，具有较强的适应性，可在土壤较为贫瘠的条件下正常生长[5]。赵贝贝对欧李树体矿质营养研究发现，欧李主根与须根系中氮含量最高，高于磷、钾、镁、铁等元素[6]，推测定殖于其根系中的固氮微生物发挥着重要作用。因此从其根系中分离筛选出内生固氮菌的概率较高。定殖于植物根系的内生固氮菌，占据着植物组织内有利于营养供应和微环境稳定的生态位，避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争，较根外环境更有利于形成高效固氮系统，可充分发挥固氮效能[7-8]。该系统为宿主植物提供氮素来源的同时增加了土壤肥力[9]。方华舟等[10]用含固氮菌的复合菌剂处理稻田土壤后，有效促进了土壤氮、磷、钾转换，提高了土壤养分含量。研究发现，内生固氮菌还可通过溶磷、分泌植物生长素(Indole acetic acid,IAA)和铁载体等改善宿主植物营养吸收，进而促进植物生长并提高产量[11-12]。韩梅等[13]从健康玉米植株中分离纯化出2株内生固氮菌，接种后发现对玉米苗期的生长有明显的促进作用。

目前，国内外学者在农作物、牧草和林木中都已分离获得内生固氮菌[14-17]，但对于荒漠草原灌木欧李内生固氮菌还缺乏相关报道。本研究对从欧李根系分离获得的内生固氮菌进行固氮及其他特性研究，筛选出固氮能力较强的菌株，通过16S rDNA基因序列比对确定菌株的分类地位,以期为欧李固氮微生物接种剂的进一步研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1植物材料 2021年1月于宁夏回族自治区银川市永宁县(38.25° N，106.07° E，海拔1 110 m)挑选生长旺盛的3株3年树龄欧李植株，距地面约35 cm处，截取其根系，装入无菌自封袋，放置于冰盒中，运回实验室4℃冰箱中保存，备用。

1.1.2培养基 无氮(Nitrogen free medium，NFM)培养基[18]用于内生固氮菌的分离及固氮酶活性测定；King氏液体培养基[19]用于内生固氮菌分泌IAA特性测定；无机磷(National botanical research institute’ s phosphate，NBRIP)液体培养基[20]用于内生固氮菌溶无机磷特性测定；蒙金娜有机磷培养基[21]用于内生固氮菌解有机磷特性测定；LB(luria bertani)固体培养基[19]用于内生固氮菌的保存与培养。

上述培养基均在121℃下，灭菌26 min，固体培养基倾倒于9 cm的灭菌培养皿中。

1.2 试验方法

1.2.1内生固氮菌分离 将3株欧李根系置于水下冲洗干净表面泥土和其他杂质，移入无菌超净工作台，用无菌水冲洗3次，后用无菌滤纸吸干表面水分。进行75%乙醇3 min，2.5%次氯酸钠7 min，75%乙醇20 min的三步表面消毒。消毒后的植物根系，用无菌水冲洗6次，后用无菌滤纸吸干表面水分，以最后1次无菌水洗涤液涂布于LB固体培养基上，28℃培养24 h，观察是否有菌长出，以此检测消毒是否彻底。将3株灭菌根系分别用无菌刀片切成约为1 g的小块，用高压灭菌后的研磨棒和研磨钵在9 mL的无菌水中研磨，每株植物根系3次重复。吸取上述织组悬浮液0.1 mL涂布于NFM平板上。接种平板置于28℃恒温培养箱培养3～7 d。

1.2.2内生固氮菌的初筛 选取NFM培养基中生长较快，菌落形态较大的不同单菌落，进行反复四区划线[22]，纯化后的菌株即为固氮菌。将固氮菌悬浮于20%甘油，保存至—80℃冰箱中备用。

1.2.3内生固氮菌固氮酶活性及促生特性测定 内生固氮菌固酶活性采用乙炔还原法测定[23]；溶磷特性采用钼锑抗比色法测定[24]；合成植物生长素IAA特性采用Salkowski法测定[25]。

1.2.4优良内生固氮菌株初步鉴定 16S rDNA基因序列扩增：通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[26]。PCR反应体系(50 μL)：2×Taq PCR Master Mix 25 μL,DNA模板4 μL、引物各1.5 μL和ddH2O 18 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 5 min。PCR产物由兰州天启基因生物科技有限公司测序。将测序结果在Ezbiocloud数据库中与模式菌株进行同源性比对。选取相似度超过95%的模式菌株相应序列进行系统进化分析，使用MEGA 7.0软件中ClustalW进行多重比对后，利用邻近法(Kimura 2-parameter模型；Bootstrap 1000)构建系统发育树。

1.2.5数据分析 使用Microsoft Excel 2010进行数据整理计算；SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，显著性水平为P<0.05；图中数据为“平均值±标准误”并使用Origin 2021作图；利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 欧李根系内生固氮菌的初步筛选

从欧李根系内分离出20株内生固氮菌，分别为NS1 14-2，NS1 14-1，NS 8，NS 22，NS 25，NS 26，YNS 3，YNS 10，YNS 6，YNS 1，YNS 4，WNS 26，WNS 24，WNS 22-1，WNS 21，NNS 15，NNS 18，NNS 17，NNS 14和NNS 19。

2.2 欧李内生固氮菌固氮酶活性

对20株欧李内生固氮菌的固氮酶活性进行测定发现，固氮酶活性范围在31.45～424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1之间，其中菌株NS 25固氮酶活性(424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1)显著高于其他菌株(P<0.05)。其次为菌株NS1 14-2(323.36 nmol C2H4·h-1·mL-1)和菌株NS1 14-1(305.63 nmol C2H4·h-1·mL-1)。此外固氮酶活性在200～300 nmol C2H4·h-1·mL-1之间的菌株有7株，分别为NS 8，NS 26，YNS 6，YNS 1，WNS 21，NNS 15和NNS 19。其他菌株固氮酶活性均小于200 nmol C2H4·h-1·mL-1。结果表明欧李根内具有丰富的固氮微生物资源(图1)。

图1 欧李内生固氮菌固氮酶活性

2.3 欧李内生固氮菌溶磷和分泌IAA特性

通过测定20株内生固氮菌合成植物生长素IAA能力发现，植物生长素IAA合成量在3.86～47.00 μg·mL-1之间，菌株NS 22合成IAA量(47.00 μg·mL-1)显著高于其他菌株(P<0.05)。其中合成IAA量大于20 μg·mL-1的菌株有5株分别为NS1 14-2，NS 22，NNS 18，NNS 17和NNS 14(图2)。

图2 欧李内生固氮菌分泌IAA

分离菌株解有机磷量在26.62～99.18 μg·mL-1之间，各菌株培养液pH在3.42～5.52之间，菌株YNS 4(99.18 μg·mL-1)，NS 8(78.45 μg·mL-1)和YNS 6(72.88 μg·mL-1)解有机磷量显著高于其他菌株(P<0.05)，剩余菌株解有机磷量均小于65 μg·mL-1(图3)。分离菌株溶无机磷量测定中，各菌株培养液pH值在5.33～6.82之间，菌株WNS 21(20.31 μg·mL-1)和NNS 14(16.12 μg·mL-1)溶无机磷量显著高于其他菌株(P<0.05)，剩余菌株溶无机磷量均小于17 μg·mL-1(图4)。供试的20株内生固氮菌均能够同时解有机磷和溶无机磷，不同菌株溶磷量不同。另外，这些内生固氮菌表现出解有机磷量大于溶无机磷量。

图3 欧李内生固氮菌解有机磷

图4 欧李内生固氮菌溶无机磷

2.4 欧李优良内生固氮菌初步鉴定

筛选10株固氮酶活性大于200 nmol C2H4·h-1·mL-1的菌株进行鉴定，将测序结果在Ezbiocloud数据库中与模式菌株进行相似性比对。结果显示，菌株NS1 14-1，NS1 14-2与短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)模式菌株相似度分别为99.38%和98.90%，并处于同一进化分支；菌株NS 25和NS 26与副地芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)模式菌株相似度分别为99.11%和98.77%，并处于同一进化分支；菌株YNS 1与耐寒短杆菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)的相似度为99.11%，并处于同一进化分支；菌株WNS 21，NNS 15与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)模式菌株相似度分别为99.14%和99.36%，并处于同一进化分支；菌株NS 8与梓树类芽孢杆菌(Paenibacilluscatalpae)模式菌株相似度为98.47%，并处于同一进化分支；菌株YNS 6与坚强细胞芽孢杆菌(Cytobacillusfirmus)模式菌株相似度为98.86%，并处于同一进化分支；NNS 19与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)相似度为99.05%，与副地芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌模式菌株处于同一进化分支(图5)。

图5 基于16S rDNA基因序列构建10株内生固氮菌系统发育树

3 讨论

高效利用固氮微生物的前提是优良菌株的挖掘与鉴定。本研究以欧李根系为研究材料，利用无氮培养基，分离获得20株内生固氮菌。从中筛选出10株固氮酶活性在200～450 nmol C2H4·h-1·mL-1之间的菌株，通过16S rDNA基因序列进行比对，这10株内生固氮菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、细胞芽孢杆菌属(Cytobacillus)和短杆菌属(Brevibacterium)。类芽孢杆菌属和芽孢杆菌属曾多次从小麦、珠芽蓼、蚕豆和马铃薯等植物中获得[27-31]。说明该菌属在植物体内生长数量多,是内生固氮菌的优势菌群，具有较强的地域广泛性和作物适应性，这对于今后微生物接种剂的生产应用具有重要意义。

在固氮酶活性测定中，固氮酶活性最高为菌株NS 25(424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1)。傅晓方等[32]从玉米中分离内生固氮菌，固氮酶活性最高为591.9 nmol C2H4·h-1·mL-1；李倍金等[33]从高羊茅根系中分离内生固氮菌，固氮酶活性最高为2 865 nmol C2H4·h-1·mL-1，表明宿主植物种类不同，可能是内生固氮菌固氮酶活性出现差异的原因之一。此外内生固氮菌NS 25被初步鉴定为副地芽孢杆菌，然而目前关于副地芽孢杆菌的固氮能力的研究却鲜见报道。Ramírez-Cario等[34]研究发现副地芽孢杆菌对致使植物感染枯萎病的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和早疫病的链格孢(Alternariaalternata)均具有一定的拮抗能力[35]。Anand等[36]将固氮菌接种于凤梨后，可显著增加其叶片中的氮含量。推测该菌株在为欧李提供氮源方面发挥出积极作用外，对欧李真菌性病害的发生也具有一定的防治作用。

本研究从欧李根系中分离的内生固氮菌，除具有丰富的固氮酶活性之外，还兼具分泌IAA和溶磷的能力。分泌植物生长素IAA的菌株可通过刺激植物根毛形成，增加侧根和主根数量及长度，形成一个高度分枝的根系系统，从而增强植物对矿质营养和水分吸收的能力，并为其他有益微生物附生创造有利条件[37]。Ying等[38]研究发现,IAA产生菌(Pseudomonassp.和Burkholderiasp.)使拟南芥幼苗根系高度分枝，根系变长。本研究分离的内生固氮菌均具有合成IAA的能力，如将这些菌株接种于欧李根部，对于欧李在极端环境下吸收更深层土壤中的水分和营养物质，同时对其固着土壤，发挥治理水土流失的生态作用具有重要意义。有研究证明，具有溶磷作用的内生菌，能够对土壤中有机磷与难溶性磷酸盐进行溶解[39]，有利于宿主植物在磷素较少的土壤中生长。陆蓝翔等[40]从樟树中分离获得2株溶磷能力较强的菌株(ZS-1和ZS-3)，在接种樟树扦插苗后，可有效地促进其生长。本研究分离的内生固氮菌解有机磷量最高为99.18 μg·mL-1，溶无机磷量最高为20.31 μg·mL-1。说明此次分离的内生固氮菌株还可通过提高欧李对环境中磷元素吸收利用来促进其生长。

另外，综合20株内生固氮菌在固氮酶活性、分泌IAA和溶磷特性测定结果发现，部分不同种属菌株、相同种属菌株间的特性测定结果存在差异，这可能与菌株自身遗传特性有关[41]。此外，不同菌株对最适生长的培养基组分和培养条件的需求存在很大差异[42]，可能也会导致此现象的发生。

4 结论

本研究从欧李根系中分离获得的20株内生固氮菌具有固氮酶活性和其他特性(溶磷和分泌植物生长素IAA)，对欧李的生长具有一定的促生潜力。从中筛选10株优良内生固氮菌经鉴定共有芽孢杆菌属(Bacillus)7株、短杆菌属(Brevibacterium)1株、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)1株和细胞芽孢杆菌属(Cytobacillus)1株。本试验丰富了固氮微生物接种剂菌种资源库。