三氟淫羊藿素对慢性炎性痛大鼠的抗炎消肿作用

孙亚兰，贾丹丹，黄 诚

（1.赣南医学院2018级硕士研究生；2.赣南医学院2019级硕士研究生；3.赣南医学院基础医学院；4.赣南医学院疼痛医学研究所，江西 赣州 341000）

由组织损伤或炎症引发的慢性炎性痛是一个重要的公共卫生健康问题［1］。目前，临床上对慢性炎性痛的治疗一般采用抗抑郁药、抗惊厥药、环氧合酶抑制剂和非甾体类抗炎药，但这些治疗方案存在较多的不良反应［2］。因此，探寻安全有效且不良反应小的药物是治疗慢性炎性痛的关键问题。越来越多的研究显示，中药利用多组分和多靶点的优势，可以显著提高慢性炎性痛的治疗效果［3］。文献报道，淫羊藿素（Icaritin，ICT）具有抗炎、镇痛和镇静催眠作用［4］，而三氟淫羊藿素（Trifluoro-icaritin，ICTF）是由淫羊藿素进行化学结构修饰而成，我们课题组前期研究发现，ICTF 可抑制自噬并激活Notch1 信号而发挥神经保护作用［5］。但ICTF 对完全弗氏佐剂（Complete freund's adjuvant,CFA）诱导的慢性炎性痛大鼠抗炎作用及机制尚不清楚，有待进一步研究加以阐明。众所周知，胆碱能抗炎通路（Cholinergic anti-inflammatory pathway，CHAIP）是中枢神经系统调节免疫反应和抑制炎症的一种生理机制［6］，而α7nAChR 作为胆碱能抗炎通路的关键受体，参与并调节这一炎症反应［7］。基于此，本实验将探讨ICTF 是否对CFA 诱导的慢性炎性痛大鼠具有抗炎消肿作用，并对ICTF的可能作用机制进行初步研究，为慢性炎性痛的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组SPF 级雄性SD 大鼠，体重150～170 g（6～8周），由湖南斯莱克景达实验动物有限公司［许可证号：SCXK（湘）2016-0002］提供。饲养在12 h 光照/12 h 黑暗、舒适和安静的环境中，保持室温（24±1）℃。大鼠在实验期间可自由获取食物和水。待大鼠适应环境5 d 后，将大鼠随机分为3组：Ctrl组（n=15）、CFA组（n=13）和CFA+ICTF组（n=8）。我们前期实验发现，3 mg·kg-1ICTF 对CFA 诱导的慢性炎性痛的治疗效果最佳，因此，给予CFA+ICTF 组大鼠每天腹腔注射1 次ICTF（用DMSO 配制浓度为6 mg·mL-1的ICTF，腹腔注射体积：每100 g体重注射0.05 mL 的ICTF），共持续21 d，并于第21 d取材。所有大鼠研究行为均严格遵守赣南医学院动物伦理委员会规程和要求。

1.2 仪器设备和化学试剂肢体肿胀测量仪（意大利，UGO ABSILE S.R.L），自动脱水机（美国，赛默飞世尔科技），石蜡切片机（美国，赛默飞世尔科技），光学显微镜（德国，LEICA），ICTF（上海辰香医药科技有限公司，批号为CX190625001），CFA（Sigma，SLCC3348），DMSO（Solarbio，D3870）。

1.3 CFA大鼠模型的建立应用异氟烷（2%～3%）对SD 大鼠实行吸入麻醉，当SD 大鼠出现麻醉状态时（掐尾巴无反应），将麻醉的SD大鼠摆放为右侧卧位，充分暴露左后肢，用碘伏消毒后于单侧左后足底注射100 µL CFA（整个过程中注意观察SD 大鼠的呼吸情况），注射完毕后停止麻醉，待其清醒后放回笼中以备后续实验。

1.4 足趾容积的测定应用肢体肿胀测量仪测量大鼠后爪水肿情况，其测量分辨率是0.01 mL。测量杯内放入溶液，液面于两红线之间，用探头进行校准后进行实验。实验前用Mark笔分别在大鼠左、右踝关节相同位置画一标记线，待大鼠平静后将左后爪放入测量杯，当液面与标记线重合时踩脚踏板，记录测量值（重复测量3次取均值），用同样的方法测量右爪，记录测量值（重复测量3次取均值）。

1.5 HE 染色大鼠进行内灌注后取左后爪组织用生理盐水冲洗干净，置于4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋和切片（4µm），将切好的片子放入60 ℃烘箱烘片8 h待用。对石蜡切片脱蜡水化，二甲苯（Ⅰ）中脱蜡6 min，二甲苯（Ⅱ）中脱蜡6 min，无水乙醇5 min，95%乙醇2 min，80%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸馏水2 min。经苏木素染色7～8 min后，将载有载玻片的玻片架放入装有自来水的烧杯内，上下冲洗20次（上下速度轻柔均匀，以苏木素不渗出为适）。自来水浸泡15 min 后（若颜色较淡，可适当减少时间为5 min，偏蓝则可以在烧杯中加入少量醋酸或酸性溶液、延长时间等），用伊红染液染色2 min，再在自来水浸泡5 min，然后进行脱水、透明和封片，95%乙醇（Ⅰ）1 min，95%乙醇（Ⅱ）1 min，无水乙醇（Ⅰ）1 min，无水乙醇（Ⅱ）1 min，二甲苯（Ⅰ）1 min，二甲苯（Ⅱ）1 min，用中性树胶封固并镜下观察。

1.6 分子对接通过Brookheaven（美国，The university of California）蛋白数据库获取α7nAChR 蛋白的晶体结构，应用UCSF Chimera 1.3（美国，The university of California）程序去除α7nAChR 蛋白晶体结构中的水分子和原始配体等。另外，应用AutoDock Tools（美国，Scripps Research Institute）软件为α7nAChR 加上电荷和非极性氢，并设置受体分子α7nAChR 分别与原始配体洛贝林和ICTF 的网格，运行AutoGrid 4.0（美国，Scripps Research Institute）生成图像文件，最后应用AutoDock 4.0（美国，Scripps Research Institute）软件进行分子对接和实验运算。以抑制常数（Inhibition constant，Ki）和结合自由能（Binding energy，△Gbind）作为参考指标，以洛贝林原始配体为阳性对照，获取ICTF 活性成分与α7nAChR 对接的Ki值和△G 值，并结合构象进行分析。

1.7 统计学方法应用统计软件Prism 8.0进行数据分析，结果以平均值±标准误表示，多组间两两差异分析采用单因素方差分析（One-way，ANOVA），然后进行Newman-Keul 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICTF 对CFA 诱导的慢性炎性痛大鼠足趾肿胀和炎症的影响为了探究ICTF 对CFA 诱导慢性炎性痛大鼠足趾肿胀的影响，我们应用肢体肿胀测量仪和HE 染色，分别检测各组大鼠后爪的体积以及足底组织的炎症程度。注射CFA 后的第1 d，大鼠爪子肿胀程度达到峰值，在第7 d 有所缓解，在给予ICTF（3 mg·kg-1）的第14 d，发现爪子肿胀程度有所减轻（P＜0.05），继续治疗后的第21 d 仍能显著改善大鼠爪子的肿胀程度（P＜0.01）（图1A）。各组大鼠左后爪在第0（即造模前1 d）、1、7、14 和21 d 拍摄的形态图像，可以看出在第1 d，与Ctrl 组相比，CFA 组大鼠爪子出现显著红、肿现象；在给予ICTF的第14 d，CFA大鼠爪子颜色及肿胀程度有所改善，而连续给予ICTF 治疗后的第21 d，CFA 大鼠爪子颜色和爪子肿胀程度得到进一步改善（图1B）。为进一步验证ICTF 对CFA 大鼠的影响，我们应用HE 染色观察ICTF 对第21 d CFA 大鼠足底组织炎症情况的影响，与Ctrl 组相比，CFA 组的炎症细胞浸润增加，而与CFA 组相比，经ICTF 治疗21 d 后炎症细胞浸润显著减少（图1C、图1D）。

2.2 ICTF 与α7-AChBP 分子对接情况通过对接模拟预测ICTF 与α7nAChR 间的结合模式和亲和力进行药物的虚拟筛选。我们发现ICTF 化学结构式与α7nAChR 激动剂洛贝林（Lobeline，LOB）化学结构式具有相似性［8］。此外，LOB 为α7nAChR 与乙酰胆碱结合蛋白（Acetylcholine binding protein，AChBP）嵌合体α7-AChBP 的原始配体［9］。从对接数据看（图2A），LOB 与α7-AChBP 对接的抑制常数（Ki）为1.68 µmol·L-1，结合自由能（△G）为-7.88 kcal·mol-1，结合能力强，ICTF 与α7-AChBP 对接的Ki 为5.59 µmol·L-1，△G 为-7.17 kcal·mol-1，具有较强的结合能力。

随后，我们从构象上分析LOB和ICTF与α7-AChBP的结合情况（图2B、图2C、图2D）。从对接最佳构象图我们可以看到，LOB 与α7-AChBP 对接情况显示，LOB 的两个芳香环夹在高度保守的芳香残基上，洛贝林哌啶环上氮原子质子化后，其上的氢原子与自身结构中的醇羟基和酮基形成分子内氢键相互作用力。ICTF 可与α7-AChBP 的活性区稳定结合，并且ICTF 与Ser144 残基形成氢键，从空间位置上ICTF与α7-AChBP的活性位点也相匹配。

图2 ICTF与α7-AChBP的分子对接数据和分子对接构象图

3 讨论

慢性疼痛是一个全球性的卫生健康问题，已达流行病的程度［10］。据估计，每年有20%的成年人患有疼痛及相关疾病，其中10%被诊断为慢性疼痛。尽管慢性疼痛的发病率很高，但关于这种疾病的发生机制尚不完全清楚，迫切需要更好缓解疼痛的疗法［10］。目前治疗慢性疼痛新靶点的发现和效果更好镇痛剂的开发依赖于各种临床前的动物模型，其中CFA 模型是用于研究慢性炎性痛的经典模型之一［11-12］，在大鼠足底皮下注射CFA 后产生局部炎症，主要表现为红、肿、热、痛和功能障碍等症状［13］。研究表明，在CFA 注射部位可产生组织炎症并释放大量的细胞因子，而促炎细胞因子的释放（如TNF-α、IL-1β和IL-6）是诱导慢性炎性痛发生发展的主要原因［14］。目前，慢性炎性痛的临床治疗一般采用抗抑郁药、抗惊厥药和非甾体类抗炎药［15-17］，但通常慢性炎性痛症状在治疗后数月或数年又重新出现，长期使用现有药物出现较大的不良反应，可见，寻求更好的临床治疗方式仍然面临挑战。

ICTF 作为ICT 的衍生物，其化学结构与雌激素类似，且长期使用不良反应较小［5］。基于我们课题组前期研究结果，本研究初步探索ICTF对CFA诱导的慢性炎性痛大鼠是否具有抗炎消肿作用。我们发现，注射CFA 后第1 d 大鼠爪子出现严重的红肿症状并达到高峰，这与TAN S S 等［18］研究结果相一致，而经ICTF 治疗后的第14 d，CFA 大鼠爪子的肿胀程度显著减轻并持续到第21 d。足趾形态图结果显示，注射CFA 后大鼠爪子出现明显的红肿症状，而经ICTF治疗后，从大鼠爪子外观可以看出皮肤颜色基本恢复到正常水平，且肿胀程度有所减轻。同时，我们通过组织病理学分析结果发现，CFA 可引发足底组织大量炎性细胞浸润，而经ICTF 治疗后，其炎性细胞浸润显著减轻。总之，ICTF 可有效减轻CFA 诱导的慢性炎性痛大鼠足趾肿胀程度和炎性细胞浸润，提示其具有抗炎消肿作用。

文献报道，CFA 中灭活的结核杆菌可与多种模式识别受体相互作用，并引发持续数周的炎症反应［19］。α7nAChR 作为胆碱能抗炎系统中的关键受体，可抑制神经炎症参与并调控慢性炎性痛的发生发展过程［20］。研究表明，α7nAChR 的激活在镇痛和抗炎方面起重要作用［21］。分子对接技术是一种基于计算机运算而广泛应用于筛选药物的方法，其能够识别具有治疗作用的新化合物，并在分子水平上预测配体-靶标的相互作用，或描绘其构效关系［22］。本实验的分子对接结果显示，ICTF 可有效地与α7nAChR 结合。此外，ICTF 与α7nAChR 的激动剂LOB 具有相似的化学结构，基于此，我们推测ICTF的抗炎消肿活性可能与活化α7nAChR 的表达有关，但其作用机制还需进一步阐明。

综上所述，慢性炎性痛的潜在发病机制非常复杂，目前的治疗药物不良反应较多［23-24］。开发和探索新的治疗慢性炎性痛的药物为当前面临的巨大挑战。我们研究发现，ICTF可能通过激活α7nAChR对CFA 诱导的慢性炎性痛大鼠发挥抗炎消肿作用，这将为慢性炎性痛的临床治疗提供新药物和新思路。