基于红外纳米谱学技术的人类头发黑素体研究

鲁 瑶 彭蔚蔚 吉 特 朱化春 王 杰 赵红卫廖泽坤 薛艳玲 陈 敏

1（中国科学院上海应用物理研究所 上海 201800）

2（中国科学院上海高等研究院上海光源 上海 201204）

3（中国科学院大学 北京 100049）

头发对哺乳动物来说最重要的是提供隔热，还包括保护皮肤免受有害的紫外线辐射，并通过排汗促进降温等好处。人类头发横截面由三个主要区域组成：髓质层、皮质层和表皮层，其中面积最大的区域就是皮质层。皮质层中有一种独特细胞器称为黑素体，黑素体的作用是生成黑色素［1］，黑色素是一种生物多聚体［2］。在人体形成头发时，如果黑素体细胞制造了数以千计的黑色素，头发就会染成黑色［3］，可以说黑素体赋予了表皮、头发和虹膜等结构颜色，同时具有许多复杂的生物学功能，与阿尔茨海默病、白化病和皮肤癌等不同疾病相关［4］。

近年来，人类头发中的黑素体一直受到广泛研究关注。1993年，Hach等［5］用氢氧化钠从人的头发中分离出黑素体，并检测了各种动物的黑素体的形态参数；2000年，Novellino等［6］开发了一种酶相关的方法，可以在温和的条件下从头发中分离出黑素体；2002年，贾虹等［7］主要对皮肤中黑素细胞和黑素作用以及黑素生成的调控机理进行了研究；2003年，Liu等［8］同样使用酶相关的方法将黑素体分从头发中分离出来，并观察到完整的头发黑素体形态，呈椭球状，长轴约为1μm，长宽比约为2.5；2012年，Como等［9］研究了不同种族和不同年龄头发的黑色素含量和成分，并发现真黑素的含量随着年龄的增长而增加；2017年，Takashi等［10］分析了不同年龄段的日本女性的头发黑色素，探讨了年龄、头发颜色、黑素体形态和黑色素组成之间的关系。这些工作利用化学处理后提取出的黑素体进行研究，但这种对头发的化学处理有可能会改变黑素体的化学性质和结构，需要一种对头发破坏性更小的方法对头发中的黑素体的尺寸以及含量进行研究。

光热诱导共振技术（Photothermal induced resonance，PTIR，也 称Atomic Force Microscopy Infrared，AFM-IR）是近年来的热门技术［11］，在国内二维材料的研究中有很多应用［12］，但还未应用于头发中黑素体的研究。它集成了原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）和可调谐红外激光器，使用AFM尖端来检测表面分子振动跃迁引起的红外吸收后的局部热膨胀，可以突破衍射极限来获得纳米分辨的红外光谱和化学成像，具体空间分辨率由探针尖端半径决定。2014年，Curtis等［13］用AFM-IR研究了白种人男性头发脂质的分布，在皮质层的边界上清楚地观察到结构脂质的积累。2018年，Stanic等［14］利用红外纳米光谱技术对黑白羊毛进行了化学和结构表征，测量分析了羊毛中角蛋白指纹谱以及黑羊毛中黑素体的化学特性。2020年，Fellows等［15］利用AFM-IR在两个光谱区研究了人头发角质层的纳米形貌和化学结构。同样在2020年，在法国SOLEIL光源，Bildstein等［16］在25 nm厚的细胞间隙直接检测游离和结合脂质，研究了人头发中脂质的亚细胞分布。上述工作充分证实了AFM-IR研究复杂生物材料的潜力，可应用于头发中黑素体的分布和尺寸的原位研究。

本文利用红外纳米光谱技术对人类头发中的黑素体进行了研究，在纳米尺度下获得了黑素体的化学成像以及形貌尺寸和分布等信息，为研究头发中的黑素体及其他黑色素相关的器官提供一个新视角。

1 实验方法及样品制备

1.1 样品选取及制备

通过光学显微镜以及同步辐射红外谱学显微技术对若干志愿者的头发进行筛选，志愿者人种均为蒙古利亚黄种人，挑选出的头发具有典型的分布特征，以及确保头发的结构是完整的，有髓质且无拉伸和破损，具有代表性，选取出进行对比实验的头发均出自同一个人，用去离子水对头发清洗备用。

制备同步辐射红外谱学显微技术所需的样品时，用超纯水包埋头发，用冷冻切片机进行切片，制备3μm的切片，放置在氟化钡衬底上。为了在纳米AFM-IR测量中获得较好的成像质量，制备AFM-IR样品时，将头发包埋入树脂中，制备成80 nm厚的切片，并放置在镀金衬底上，以此得到黑头发和白头发横截面切片样品。

1.2 同步辐射红外谱学显微

首先在上海光源BL06B线站［17］上进行了同步辐射红外谱学显微测量，以确保头发样品的化学结构完整。红外显微镜光阑设置为6 mm×6 mm。以2 cm-1的分辨率的同步辐射光源记录光谱，并使用OPUS软件对光谱和图像数据进行处理。实验结果如图1所示，测得黑头发中皮质层和髓质层的红外光谱以及化学成像，可以看到完整的三层结构，清晰地区分表皮层、皮质层和髓质层。同步辐射红外谱学显微技术受到衍射限制，空间分辨率限制在微米量级，无法观察到黑素体，需要进一步利用AFM-IR技术对黑素体的形貌分布和化学成分进行表征。

图1 人类黑头发切片的化学成像和红外光谱(a)黑头发在3 280 cm-1的化学成像，(b)黑头发髓质层和皮质层的红外光谱Fig.1 Chemical imaging and infrared spectroscopy of human black hair(a)Chemical image of black hair at 3 280 cm-1,(b)IR spectra of medulla and cortex in black hair

1.3 红外纳米光谱和化学成像

AFM-IR测量使用了Bruker公司的NanoIR3仪器。该仪器配备了QCL激光器组，可采集的光谱范围为916~1 666 cm-1。在接触模式下获取AFM形貌，扫描速率为0.3 Hz，扫描范围为5~10μm的正方形，图像分辨率设为256×256像素。用激光器发射的红外光照射扫描尖端和样品，可以得到样品上每个待研究点的红外光谱，以及特定范围内的化学成像，光谱分辨率设置为2 cm-1。形貌图和红外谱图以及化学成像使用Analysis 3.7软件处理。

2 分析与讨论

2.1 黑素体纳米红外光谱和化学成像

首先采集了头发横截面的AFM形貌图（图2），清晰地观察到髓质层、皮质层和表皮层纳米尺度下的形貌图，可以明显地看出，头发三层区域之间的结构差别。其中，髓质层多孔，表皮层由6层结构紧密排列组成，皮质层的区域最大，结构致密，中间夹杂着椭圆形颗粒。

图2 人类头发横截面不同位置的AFM形貌图 (a)表皮层，(b)皮质层，(c)髓质层Fig.2 AFMtopography of human hair cross-section at different locations (a)Cuticle,(b)Cortex,(c)Medulla

进一步对黑头发和白头发的皮质层结构进行了研究。AFM形貌图（图3）显示，皮质层均有紧密的蛋白质排列，黑头发与白头发之间存在明显的形态差异，黑头发形貌图出现区别于周围皮质层结构的椭圆形凸起部分，如图3（a）中箭头所示，而白头发的横截面形貌图没有观察到这种椭圆状结构，推测椭圆形结构为黑素体。

图3 黑头发和白头发皮质层的AFM形貌图 (a)黑头发，(b)白头发Fig.3 AFMtopography of cortex in both black hair and white hair (a)Black hair,(b)White hair

利用纳米红外光谱技术对疑似黑素体的椭圆形结构进行了光谱分析，并比较了皮质层其他区域的红外光谱，如图4所示。图4（b）显示了椭圆形结构的红外光谱，主要有4个特征红外波段：1 122 cm-1处的S=O伸缩振动、1 200~1 300 cm-1范围的酰胺III带、1 400~1 600 cm-1范围的酰胺II带以及1 600~1 700 cm-1的酰胺I带。图4（c）显示了椭圆型结构之外皮质部分的红外光谱，在1 640 cm-1左右出现明显的酰胺I带的峰，在1 530 cm-1出现明显的酰胺Ⅱ带的峰，主要成分为蛋白质。而椭圆形部分在酰胺I带II带和III带的部分红外光谱吸收强度较小，蛋白质的吸收强度相对皮质其他区域较弱，在1 586 cm-1处出现了皮质其他区域所没有的明显的特征峰，该特征峰为C=O伸缩振动，可以判断该椭圆形结构为黑素体［10］。

图4 黑头发皮质层中的黑素体区域和其他区域的红外光谱(a)皮质层的AFM形貌图，(b)黑素体的红外光谱，(c)皮质层非黑素体区域的红外光谱Fig.4 Infrared spectra of melanosome and the other region in black hair cortex(a)AFM topography of cortex,(b)Infrared spectrum of melanosome,(c)Infrared spectrum of cortex

利用1 586 cm-1的黑素体特征峰和1 640 cm-1的酰胺I带蛋白质峰对皮质层进行化学成像，如图5（a）所示，可以明确地对黑头发皮质层中的黑素体进行定位。结合特征光谱分析，在1 586 cm-1成像时，红外吸收较强的区域为黑素体，在1 640 cm-1成像时，吸收较强的部分为蛋白质。为了更清晰获得黑素体的形貌和分布信息，对1 586 cm-1和1 640 cm-1处的化学成像图的结果作比，得到图5（b）的图像，这样可以忽略样品的纵向起伏带来的误差，更清晰直观地定位到黑素体的位置，方便进一步分析头发中黑素体的形貌尺寸和分布。

图5 黑头发皮质层的形貌图、化学成像以及处理后的化学成像(a)黑头发皮质层的AFM形貌图和在1 586 cm-1及1 640 cm-1的化学成像图，(b)黑头发皮质层黑素体区域的1 586 cm-1/1 640 cm-1的3D图Fig.5 AFMtopography,chemical image and ratio image of black hair cortex(a)AFM topography and the chemical image of black hair cortex at 1 586 cm-1 and 1 640 cm-1,(b)3D view of 1 586 cm-1/1 640 cm-1 ratio in the area of melanosome in black hair cortex

2.2 黑素体形貌和分布

结合黑素体的形貌图以及化学成像图可以知道，黑头发皮质区域中的黑素体直径大小为200~600 nm，大多数呈椭球形，有些形状呈较为细长的椭球形，有些呈较圆的椭球形。与白种人相比［12］，亚洲人头发中的黑素体形状与其较为相似，但大小与之相比较大，并且紧紧地包裹在皮质层蛋白质中。

为更准确分析黑素体的分布情况，把头发横截面中的皮质层部分按轴向由中心向外层分成了4个区域，由内到外按照半径平分，每个区域厚度约为10μm，各区域内1 586 cm-1的化学成像如图6（a）所示。选取了4个样本，统计每个样本的4个区域内的黑素体个数，除以每个区域的总面积，得到该区域内平均面积中的黑素体个数如图6（b）所示。将平均面积内黑素体数量的散点图拟合成曲线后，可以清楚地看到，区域1到4的黑素体数量是递增的，区域1的黑素体数量最少，区域4的黑素体数量最多，表明越靠近表皮层的皮质部分黑素体含量越高。头发皮质层中黑素体是由内向外递增的分布趋势。

对4个黑头发横截面切片的皮质层在1 586 cm-1进行了化学成像，统计了黑素体的尺寸信息。利用AFM形貌图和化学成像图，对4个黑头发横截面切片的4个区域内共106个黑素体的长短轴进行测量。统计了长轴和短轴的长度，计算了长短轴比，假设黑素体为椭球体［18］，用椭球的体积公式来计算椭球体的长宽比和体积。

黑素体中长轴和短轴的统计结果如图7所示，按图6（a）中划分的4个区域绘制了形态参数统计图，纵轴分别代表椭球体的平均长轴、平均短轴、平均长短轴比和平均体积V。为了统一比较，对数据进行了平均值计算。数据处理的结果可知，黑素体长轴的平均值为423 nm，短轴的平均值为337 nm，长轴和短轴比值的平均值为1.26，体积平均值为0.31μm3。结果显示：黑素体的长短轴长度和长短轴比例和黑素体的体积在4个区域中的差别不大，可见黑素体在头发中的分布位置与其尺寸与没有必然联系。

图6 黑头发横截面中黑素体的化学成像和分布统计(a)头发横截面分为4个区域的示意图以及每个区域的化学成像，(b)黑素体在黑头发中不同区域的分布情况Fig.6 (a)Optical microscope image of the hair cross-section divided into four regions,with chemical imaging of each region,(b)Distribution of melanosomes in different regions in black hair

图7 黑头发皮质层中的黑素体形态参数统计 (a)长轴，(b)短轴，(c)长短轴比，(d)体积VFig.7 Statistics of morphological parameters from melanosomes in black hair samples(a)Major axis,(b)Minor axis,(c)Aspect ratio,(d)Volume V

3 结语

本文利用红外纳米光谱技术对头发皮质层黑素体的形貌、分布和红外特征光谱进行了原位表征，获得了黑素体的形貌尺寸和分布特征等。实验结果显示黑头发皮质层中存在大量的黑素体，为长短轴比平均为1.26的椭球形，长轴和短轴平均尺寸分别为423 nm和337 nm，其在黑头发皮质层中的分布由中心到外层逐渐增多。研究表明：红外纳米光谱技术可以在纳米尺度分辨率下对黑素体的化学信息和结构分布信息进行表征，证明了AFM-IR研究生物样品纳米结构的潜力，为生物样品的纳米尺度的研究提供了一种有效的方法。后续可继续利用该方法，对年龄或性别等差异可能导致的黑素体形态和化学性质变化进行进一步研究。

致谢感谢Bruker公司魏琳琳博士和刘耀纶博士在纳米红外实验方面的帮助，感谢浙江大学袁文涛教授和徐颖老师在样品制备方面的帮助。

作者贡献声明鲁瑶：负责数据采集、数据分析、起草论文；吉特、朱化春、王杰、赵红卫、廖泽坤、薛艳玲：参与实验指导和论文修订；彭蔚蔚、陈敏：负责整体方案设计和修订审核论文。