污染土壤修复技术专利分析

文|白鸽

土壤是人类生产活动的重要物质基础，是不可缺少、难以再生的自然资源，其管理使用的好坏直接决定着农业生产的成败和人类文明的兴衰。随着社会经济、科技、工业、建筑的飞速发展和高强度的人类活动，以及对后备土地的过度开发利用，可供使用的土壤资源日益紧张，土壤的流失和污染极为严重，已经影响到可持续发展的战略目标。因此，对污染土壤进行分析和修复势在必行。本文调查研究了我国利用微生物修复污染土壤的专利申请概况，结合具体专利文献对微生物修复专利技术进行了介绍。微生物修复土壤污染是一种高效、经济、绿色环保的生态修复技术。一方面，在降解、转化及固定污染物的微生物筛选、广谱性、高效性的研究工作还有待进一步开展。另一方面，应加强已有技术成果的转化，有序促进土壤修复产业发展，使基础的理论研究用于指导实践，发挥更大的社会和经济效益。

根据修复原理的不同，污染土壤修复可分为物理修复、化学修复和生物修复三种类型。由于生物修复技术较物理、化学方法经济，不易产生二次污染，且具有低耗、高效、环境安全等优点，因而近几年发展迅猛，已经成为污染土壤修复技术最活跃的领域。根据污染土壤生物修复主体不同，生物修复技术进一步分为微生物修复、植物修复和动物修复，其中以微生物修复应用最为广泛。

1 土壤污染修复相关专利技术发展态势

以专利数据库作为数据采集来源，以关键词（土壤、污染、微生物、修复）和分类号作为主要检索要素，对2021年12月31日之前公开的专利文献进行检索，获得中国发明专利及中国发明专利申请3407条，上述结果作为统计分析的基础数据。

1.1 相关专利技术现状分析

1.1.1 专利技术申请趋势分析

从图1可以看出，相关专利申请的申请量总体呈增长趋势，特别是2014年后增长更为突出，说明土壤污染问题越来越被关注和重视，越来越多的创新主体积极参与研发，2018年专利申请量达到顶峰。由于发明专利文献最迟可在发明专利申请提出后18个月公开，因此2020年和2021年提出的专利申请还有部分尚未公开。

图1 土壤污染修复技术申请趋势图

1.1.2 专利申请人类型分布情况

通过对3407条专利文献进行分析，专利申请人中大专院校占比最大，其次为企业、科研单位，余下少量为个人、机关团体或其它。图2表明，目前为止，大专院校和科研单位是技术研发和改进的主力军，专利技术需要积极转化产生价值，需要进一步加强产学研结合，从科研院校的实验室研究转化为产业化运用，提高土壤污染修复的有效性。

图2 土壤污染修复技术申请人类型分布图

2 土壤污染的类型和危害

根据污染物类型，土壤污染大致可分为无机污染物和有机污染物两大类。无机污染物主要包括酸、碱、重金属、盐类、放射性元素等。有机污染物主要包括农药、酚类、氯化物、石油、合成洗涤剂等。土壤污染一方面会造成土壤肥力降低、土壤退化，甚至导致地下水污染，威胁生态环境安全；另一方面土壤中的污染物质通过食物进入人体，对人体健康构成极大危害。可见，土壤污染直接关系到食品安全和人类健康。

对前述3407条检索结果进一步细分，其中涉及土壤重金属污染及修复的1126条、涉及有机农药污染及修复的1127条，同时涉及重金属污染和有机农药污染的321条。

2.1 土壤污染的类型及重点申请人

图3显示，有机农药和重金属离子是土壤污染修复的重点。在有机农药污染修复技术中，中南大学和湖南省农业生物技术研究中心专利申请量较多；在重金属污染修复技术中，以华中农业大学以及北京林业大学、华南农业大学、南京农业大学4所农林院校为主。

图3 土壤污染修复技术重点类型分布图

2.2 重金属污染及其危害

土壤重金属污染是指由于人类活动将金属加入到土壤中，致使土壤中重金属明显高于原生含量、并造成生态环境质量恶化的现象。重金属通常是指比重等于或大于5.0的金属，包括铅、铬、汞、锌、铜、镍等，砷的化学性质和环境行为与重金属多有相似之处，因而在讨论重金属时往往也包括砷。这些重金属元素进入水体和土壤以后通过植物吸收积累在植物的根、茎、叶、果等可食用部分，或通过叶面直接进入植物体，从而对植物和动物产生毒害作用。高浓度的铅除了在作物可食部分产生残毒外，还会导致幼苗萎缩、生长缓慢、产量下降。高浓度的镉会使谷物类作物出现类似于缺铁的萎黄病、枯斑病、萎蔫，叶片产生红棕色斑块和茎生长受阻。砷在自然界以不同形态存在，三价砷毒性大于五价砷，大于有机砷。铬是人体必需的微量营养元素，但铬的缺乏或过量将对人体和动物产生严重危害，一般认为二价铬是无毒的，三价铬是动物体必需的活性元素，六价铬是主要的环境污染物之一，铬的毒害主要表现在植物根部、地上部出现缺铁失绿现象。此外，我国是汞储备大国，也是土壤汞污染最为严重的国家。近几年我国人为排汞量在全球排放中的比重持续增大，每年达到600t左右。甲基汞的毒性比无机汞大得多，它是一种亲脂性高毒物，能引起中枢神经系统疾病，为不可逆的中毒反应。

2.3 有机农药污染及其危害

在我国北方地区，主要农作物有大豆、玉米与小麦，同时还可以种植蔬菜、中草药以及其他杂粮作物。北方地区主要以黑土地为主，土壤较为肥沃，只需要施加少量的肥料，即可促进作物生长。然而，农民为了提高产量、获得更多的经济效益，会过度使用农药，从而对土壤造成严重破坏，对人类生活造成一定威胁。

为了防治植物病虫草害，在二十世纪末有机氯农药被大量生产和过量使用，主要分为以苯为原料和以环戊二烯为原料的两大类，前者包括广泛使用的杀虫剂DDT和六六六，以及杀螨剂三氯杀螨砜、三氯杀螨醇等，杀菌剂五氯硝基苯、百菌清等。同样对植物病有防治效果的还包括有机磷农药，我国水稻田中主要施用有机磷杀虫剂，包括有敌敌畏、敌百虫、乐果、毒死蜱和草甘膦等。

一般认为，农药在施用环境条件中的有效利用率仅仅达到10%-20%，其余80%-90%的农药流失于农田土壤、河流、地下水及挥发至空气中。农药首先喷洒至土壤中，然后经挥发和淋溶进入空气和水体中，因此土壤中的农药残留浓度最大，农药污染程度最高。土壤中残留的农药会通过植物的根系活动逐渐转移至植物中，使得植物中的农药残留量增大，影响农产品的质量。农药进入土壤后，除了杀伤防治对象，还杀害土壤中其它的生物群。有机氯、有机磷农药还可经消化道、呼吸道及完整的皮肤和黏膜进入人体。有机氯农药可引起不同程度的中毒，急性中毒表现为刺激神经中枢，慢性中毒表现为食欲不振、体重减轻，也可产生小脑失调、造血系统障碍等。有机磷农药进入人体后分布于各器官，以肝脏含量最大，脑内含量取决于农药穿透血脑屏障的能力，严重时可因肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡。

3 土壤污染微生物修复技术重点专利分析

微生物修复是指利用天然存在的或者筛选培养的功能微生物或微生物群，包括土著微生物、外源微生物、诱变微生物和基因工程菌，在人为优化的适宜环境条件下，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或降低有机污染物的有效性，从而间接起到修复污染土壤的作用。通常，一种微生物能够降解多种有毒污染物，因此微生物修复成为污染土壤修复的重要领域。

3.1 从自然界筛选土壤污染修复微生物

从自然界获得天然存在的土壤污染修复微生物的主要方法是从污染环境中取样，通过驯化、筛选、分离等操作得到对污染物具有耐受性或者能够降解、吸附污染物的微生物菌株。由于特定微生物菌株的筛选方法可能涉及不能重复再现、具有随机性等实用性缺陷，因而保护主题通常为产品权利要求。例如：CN111235076B专利文献公开了一种天神芽孢杆菌及其应用。从电镀厂周边土壤及水取样，在含有Ca3(PO4)2 的解磷菌筛选培养基中进行初筛，获得17株解磷菌。进一步复筛，得到四株解磷效果达到50%以上且对金属镉具有修复效果的菌株，其中菌株P46效果最佳，经鉴定为天神芽孢杆菌。进一步通过重金属修复实验证实，菌株P46对二价镉离子、二价铅离子具有较强的钝化效果，修复效率分别可达到60%和83%以上。

CN105602855B专利文献公开了一株具有广谱农药降解特性的真菌PA F-2（分类命名为聚多曲霉）及其应用。采集湖北省蕲州镇蕲农化工有限公司新厂区周边土样及排水口水样，富集培养、分离筛选得到一株具有广谱抗性的真菌PA F-2，能够降解包括有机磷（例如敌百虫）、有机氯（例如百草枯）在内的13种农药。在加入真菌PA F-2后，敌百虫分子发生水解反应，导致分子内的C-P键断裂，从而产生亚磷酸二甲酯和水合氯醛分子，亚磷酸二甲基分子在微生物体内进一步降解为微生物可利用的磷酸盐；水合氯醛分子转化为三氯乙醛，水合氯醛以及三氯乙醛在微生物体内可被利用为碳源，合成葡糖苷酸，从而促进微生物的生长。同时，真菌PAF-2还可进一步降解敌百虫的水解产物敌敌畏，形成三甲基正磷酸盐和二氯甲烷，或者发生水解反应形成甲基磷酸二甲酯和不稳定化合物二氯乙烯醛，最终也转化为磷酸化合物。

3.2 基因工程化改造土壤污染微生物

尽管从自然界分离筛选的微生物能够在一定程度上实现污染物的降解，实现土壤的修复，但是其降解类型、降解效率受微生物对污染物降解能力和诸多环境条件的限制，因而进一步提高微生物对污染物的降解能力是本领域的普遍需求。由此，通过基因重组、构建高效基因工程菌的研究逐渐展开。构建基因工程菌可以考虑重组改造微生物的遗传背景，引入降解污染物的代谢通路，引入外源基因通过重组互补代谢途径、改变污染物代谢产物流向来优化污染物的降解途径。例如：金属硫蛋白是具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质，富含半胱氨酸的短肽，对多种金属具有高度亲和性。基于该特性，CN101892187B、CN103205454B专利文献公开了重组表达金属硫蛋白的基因工程菌及其在重金属修复中的应用。以CN103205454B为例，通过将来源于酿酒酵母的磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因构建重组表达载体，线性转化酿酒酵母S.cerevisiae4126细胞内，筛选具有重金属吸附功能的金属硫蛋白转基因酵母。实验证实，经过表达金属硫蛋白的基因工程菌能够增强宿主对铜、铬、镉离子的耐受性，使菌体对重金属的耐受性明显提高。并且，金属硫蛋白转基因重组菌对六价铬的还原速率（14h）远远大于出发菌（21h），在总铬的去除率上金属硫蛋白转基因重组菌也要优于出发菌株。铜离子吸附实验中，金属硫蛋白转基因重组菌对铜离子的吸附量是出发菌株的3倍多，显著提高了S.cerevisiae4126对铜离子的吸附能力。可见，通过导入具有重金属吸附功能的金属硫蛋白多拷贝整合载体能显著增强S.cerevisiae4126对重金属的吸附能力。

3.3 土壤污染修复微生物诱变菌株

人工诱变例如紫外照射、离子束流轰击等会导致微生物内部产生DNA断裂、基因突变、基因重组等现象，以诱发微生物体内染色体变异，改变其特性，从而筛选出具有优良变异品质的土壤污染修复微生物诱变菌株。例如：CN102690763B专利文献公开了一种具有解磷能力的成团肠杆菌，其是以具有较高解磷能力的成团肠杆菌作为出发菌株，通过紫外线诱变进行初筛，选出一株解磷活性高且稳定性好的菌株，制成菌悬液，进一步通过等离子体诱变复筛，得到一株耐受重金属且解磷活性最高的菌株。经鉴定，菌株与成团肠杆菌具有高度同源性。

3.4 土壤污染微生物复合菌剂

单一微生物降解菌的降解谱不够广、不能完全代谢土壤中的污染物类型是微生物修复效果欠佳的一个主要原因。使用特定功能的复合微生物菌，微生物之间协同作用，从而改善土壤中难降解的污染物，具有高效率、低成本的特点，在微生物修复污染土壤的应用中具有广阔的前景。所述微生物可以从保藏菌种库中筛选获得，也可以从自然界筛选分离得到。