王玲玲,吴宗丙,罗继敏,朱胜章,刘运麟
(1.黔南州人民医院病理科,贵州 黔南 550008;2.黔南州中医院病理科,贵州 黔南 550008)
宫颈癌(cervical cancer)是临床常见的恶性肿瘤之一,也是目前病因明确且可进行早期诊断和治疗的恶性肿瘤之一[1]。但是目前临床尚未形成统一的预防和筛查宫颈癌的标准,其漏诊、误诊率较高[2]。研究显示[3],宫颈癌患者癌变组织中几乎都有人乳头状瘤病毒(HPV)的表达,并发现HPV 感染也是引起宫颈癌的重要因素。由此可见,HPV 感染可能是宫颈癌的启动因子,围绕HPV 开展相关生物学研究,了解基因表达情况,对宫颈癌癌前病变转化具有重要的价值[4]。E6 或E7 基因是HPV 主要致癌基因,其荷载量、表达水平等都被认为是癌变进展的重要生物学预警指标[5]。目前,临床关于HR-HPV 载量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宫颈癌和癌前病变中表达情况的相关研究较少,其表达水平与宫颈癌的相关性还需要不断探索[6]。本研究结合2020 年5月-2021 年5 月在我院诊治的89 例HPV 持续感染患者的临床资料,探究HR-HPV 载量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宫颈癌和癌前病变的表达和意义,现报道如下。
1.1 一般资料 选取2020 年5 月-2021 年5 月在黔南州人民医院诊治的89 例HPV 持续感染患者为研究对象,年龄33~64 岁,平均年龄(46.12±2.93)岁。依据病理组织分为宫颈癌组(n=33)、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ组(n=19)、CINⅡ组(n=17)、CINⅢ组(n=20),各组年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经过医院伦理委员会批准,患者自愿参加本研究,并签署知情同意书。
1.2 纳入和排除标准 纳入标准:①均符合临床宫颈癌前病变CIN 和宫颈癌诊断标准[7];②均经病理学诊断确诊[8];③纳入患者均为女性。排除标准:①合并严重器质性疾病者;②合并恶性肿瘤、自身免疫学疾病;③HIV 阳性[9];④合并子宫或宫颈切除史。
1.3 方法 各组患者分别进行HR-HPV 载量、HRHPV E6 或E7 mRNA 检测。
1.3.1 HR-HPV 载量 采用PCR 荧光法,应用PCR扩增仪(Genesy96T,天隆科技)和HR-HPV 核酸定量检测试剂盒,试剂盒均由上海生物科技有限公司提供,主要包括16、18、31、33、45、52、56、58 型。于月经后半周期进行取样,采用阴道窥器暴露宫颈阴道部,干棉球拭净宫颈口过多黏液、血液、分泌物,贴紧宫颈口,将刷头置于宫颈管,顺时针旋转3~5 圈,停留5 s 取出,取下刷头,浸泡于含液基细胞学保存液的瓶中送检[10]。所有操作严格按照说明书进行,依据HR-HPV 载量分组:低载量组:104~105copies/ml;中载量组:105~106copies/ml;高载量组:106~107copies/ml;超高载量组:>107copies/ml[11]。
1.3.2 HR-HPV E6 或E7 mRNA 采用QuantiVirusTM便携式冷光仪和HR-HPV E6/E7 mRNA 检测试剂盒,试剂盒有北京生物有限公司提供,包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 共14 型。应用支链DNA 信号扩增法,先将样品离心5 min,去上清液,加入2 ml 双蒸水清洗,再次离心,去上清液,加入裂解液混匀,再加入蛋白酶K,65 ℃孵育1 h,留取上清,再经过布板、信号放大、添加底物等过程后[12],采用冷光仪检测,得到光子数后经软件转化为mRNA 拷贝数。
1.4 观察指标 比较各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 检出阳性率和表达水平;分析不同HR-HPV 载量(低载量、中载量、高载量、超高载量)的不同类型宫颈病发生率以及不同宫颈病变与HR-HPV 载 量、HR-HPV E6 或E7 mRNA的 相关性。
1.4.1 CIN 分级[13]CINⅠ:轻度非典型增生,排列不整齐,但仍保持极性,异常增生细胞仅占上皮层1/3;CINⅡ:中度非典型增生,排列较紊乱,异常增生细胞占上皮层的2/3;CINⅢ:重度非典型增生,失去极性,异常增生细胞扩展至上皮层的2/3 以上。
1.4.2 检出阳性标准[14]HPV DNA:如果增长曲线不呈S 型或循环阈值(Ct)为空白,则判样品的HPV DNA 总含量小于检测下限,如果增长曲线呈S 型且Ct 值<40,HPV DNA>103copies/ml 为阳性;mRNA拷贝数≥1 copy/ml 为阳性。
1.5 统计学方法 采用统计软件包SPSS 21.0 版本对本研究的数据进行统计学处理,符合正态分布的计量资料采用()表示,组间比较采用t检验;计数资料采用[n(%)]表示,组间比较采用χ2检验;使用Spearman 进行相关性分析,P<0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA检出阳性率比较 各组HR-HPV DNA 阳性率均大于阴性率,宫颈癌组、CINⅡ组、CINⅢ组HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于阴性率,CINⅠ组阳性率小于阴性率,差异有统计学意义(P<0.05);CINⅡ组HR-HPV DNA 载量阳性率与HR-HPV E6 或E7 mRNA 比较,差异无统计学意义(P>0.05);宫颈癌组、CINⅢ组HR-HPV DNA 阳性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于CINⅠ组、CINⅡ组,差异有统计学意义(P<0.05),宫颈癌组HR-HPV DNA 阳性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率与CINⅢ组比较,差异无统计学意义(P>0.05),CINⅡ组HR-HPV DNA 阳性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率大于CINⅠ组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。
表1 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 检出阳性率比较[n(%)]
2.2 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表达水平比较 宫颈癌组、CINⅡ组、CINⅢ组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平均高于CINⅠ组,差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平与CIN Ⅲ组比较,差异无统计学意义(P>0.05);CINⅠ组HR-HPV DNA 载量水平与CINⅡ组比较,差异无统计学意义(P>0.05),CINⅡ组HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平高于CINⅠ组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。
表2 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表达水平比较()
表2 各组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表达水平比较()
注:与CINⅠ组比较,*P<0.05;与CINⅢ组比较,△P>0.05;与CINⅡ组比较,**P>0.05,△△P<0.05
2.3 不同HR-HPV 载量的患者不同类型宫颈病变发生率比较 不同HR-HPV 载量的患者CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌的发生率比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。
表3 不同HR-HPV 载量的患者不同类型宫颈病变发生率比较[n(%)]
2.4 不同宫颈病变患者HR-HPV DNA 和HPV E6 或E7 mRNA的相关性 CINⅠ、CINⅡ患者中HPV E6或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 均呈正相关(r=0.431、0.709,P=0.000、0.000),CIN Ⅲ与宫颈癌患者中HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 无相关性(r=0.152、0.089,P=098、0.432)。
宫颈癌生物标志物多种多样,常规HPV 基因检测灵敏度高,可一定程度降低宫颈癌漏诊率[15]。但是由于HPV 感染的普遍性和自限性,导致HPV 分型鉴别特异度低,仅能提示感染,不能准备判断是否存在宫颈病变,更无法对其严重程度进行准确判断[16]。因此,临床缺乏前瞻性预判指标,可能会错过CIN到浸润癌的关键节点。E6 或E7 基因是HPV 主要致癌基因,HPV 感染后可将E6/E7 DNA 整合至宫颈上皮细胞基因,使其获得基因E6/E7 DNA,并进一步激活,通过宿主细胞转录出E6/E7 mRNA,进一步翻译为癌蛋白E6/E7 DNA[17]。因此,HR-HPV 载量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宫颈癌和癌前病变的表达具有重要的价值。
本研究结果显示,各组HR-HPV DNA 阳性率均大于阴性率,宫颈癌、CINⅡ、CINⅢ各组HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于阴性率,CINⅠ组阳性率小于阴性率(P<0.05),CINⅡ组HR-HPV DNA载量阳性率与HR-HPV E6 或E7 mRNA 基本一致(P>0.05),提示在比CINⅠ高等级的宫颈上皮内瘤变患者中HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于阴性率。同时,各组HR-HPV DNA 阳性率均大于阴性率,但是CINⅡ组和CINⅠ组比较,差异无统计学意义(P>0.05),进一步表明HR-HPV DNA 和HRHPV E6 或E7 mRNA 参与宫颈癌发展,与宫颈病变程度密切相关,但是HR-HPV DNA 和HR-HPV E6或E7 mRNA 载量与疾病程度有关。本研究结果还显示,宫颈癌组、CINⅢ组HR-HPV DNA 阳性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率均大于CINⅠ组、CINⅡ组(P<0.05),宫颈癌组与CINⅢ组比较,差异无统计学意义(P>0.05),但CINⅡ组大于CINⅠ组(P<0.05),表明随着宫颈上皮内瘤变等级的升高,HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率有升高的趋势,但是CINⅢ和宫颈癌差异不明显。因此,临床可通过检测HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 阳性率对宫颈癌和癌前病变进行筛查,初步对宫颈病变进行分级。宫颈癌组、CINⅡ组、CINⅢ组HR-HPV DNA 载量、HR-HPV E6 或E7 mRNA水平均高于CINⅠ组(P<0.05),宫颈癌组与CINⅢ组比较、CINⅠ组HR-HPV DNA 载量水平与CINⅡ组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),CINⅡ组HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平高于CINⅠ组,差异有统计学意义(P<0.05),表明HR-HPV DNA、HRHPV E6 或E7 mRNA 表达水平在不同疾病程度中的表达不同。但是在CINⅠ和CINⅡ之间存在的差异,而CINⅢ和宫颈癌之间差异不明显。分析认为可能由于CINⅢ患者的HR-HPV DNA、HR-HPV E6或E7 mRNA 已经处于较高水平表达,与宫颈癌存在较多的交叉重叠情况,从而差异分布不显著[18]。因此,临床可通过检测HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表达水平,来鉴别宫颈癌与癌前病变,为临床的预防和治疗提供参考依据。
本研究显示,不同HR-HPV 载量患者CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌的发生率比较,差异有统计学意义(P<0.05),表明不同HR-HPV 载量的患者不同宫颈病变比例存在差异,其中超高载量的患者变化最为明显。分析认为可能是由于宫颈癌病毒载量相对较高,其变化趋势相对更显著[19]。此外,HPV E6或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 间存一定的相关性,在CINⅠ、CINⅡ患者中,HPV E6 或E7 mRNA 与HR-HPV DNA 呈正相关,CINⅢ与宫颈癌患者中两者无相关性,该结论与吴萍等[20]的报道相似。因此,临床定量测定HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA,可一定程度提高宫颈病变的灵敏度,但是具体的诊断效能还需要进一步的临床研究证实。
综上所述,对于持续HPV 感染的患者,应动态监测HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 水平;对于较高HPV 负荷的患者,通常提示高级别(CINⅡ以上)以及严重宫颈病变可能性增加,需要加强监测和随访,以最大化提高HPV 清除率,改善患者预后。