连作烟田健株与根腐病感病烟株根际土壤微生物多样性研究

敖金成，周桂夙，李永梅

（1. 云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2. 云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201）

烟草是我国重要的经济作物之一，为茄科忌连作作物。随着人口不断增长和其他非烟经济作物种植面积的进一步挤压，优质耕地资源的供需矛盾日益凸显，致使云南烤烟连作现象日趋严重。连作引起土壤化感物质积累[1]、病原菌增加[2]、微生物结构多样性[3]和功能多样性[4]降低，造成作物土传病害发生[5]。土传病害因对烟草种植效益及烟叶品质构成严重威胁而受到广泛关注。深入认识连作土壤微生物群落演化规律是探寻有效防控作物土传病害途径的关键。

在诸多的土传病害中，烟草镰刀菌根腐病是由半知菌亚门（Deuteromycotina）镰刀菌属（Fusarium）病原菌引起的一种典型土传病害，该病危害面广，防治难度大，近年来全国核心烟区发病率呈上升趋势。有报道表明，引起烟草镰刀菌根腐病的病原菌主要为茄腐镰刀菌（F. solani）[6]和尖孢镰刀菌（F.oxysporium）[7]，可单一发生危害，也可复合发生危害。随着研究的深入，越来越多的烟草镰刀菌根腐病病原菌被发现。2018年吴忠安等[8]首次报道了共享镰刀菌（F. commune）引起烟草根腐病；2021 年QIU 等[9‑10]首次报道了由Fusarium brachygibbosum和Fusarium sinensis引起的河南烟区根腐病。连作和烟株感病均会引起土壤微生物群落结构和多样性的改变。许自成等[11]研究表明，长期连作导致土壤真菌群落结构发生变化和致病菌增多，但镰刀菌属真菌并未呈现递增趋势。在连作土壤中，镰刀菌属随着连作年限的增加逐渐成为优势真菌生理群[12‑13]。研究感染黑胫病烟株[14]和感染青枯病烟株[15]根际土壤微生物群落结构发现，感病烟株微生物群落结构发生改变，多样性降低。而在连作条件下，根腐病感病烟株土壤微生物群落结构及多样性，尤其是一些病原微生物群落丰度的变化鲜见报道。鉴于此，基于不同连作年限烟田，探讨了健康和烟草根腐病感病烟株根际土壤细菌、真菌群落结构及多样性特征，以期为连作土壤微生态环境的定向调控及土传病害的生态防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 连作土壤采集区概况及取样

1.1.1 区域概况 供试区域位于云南省曲靖市马龙区旧县镇（103°23′10″E，25°20′20″N）核心烟区，烤烟连作现象较为普遍。该烟区地处云贵高原的滇东北丘陵区，气候属于低纬高原季风型气候，年均温13.3～15.1 ℃，烤烟大田生育期降水量740.0～810.0 mm，海拔1 957.1 m。土壤类型为黄壤，供试烤烟品种为云烟87。

1.1.2 试验设计及样品采集 于2020 年7 月烤烟成熟期，在云南省曲靖市核心烟区选择不同连作年限烟田进行样品采集。分别在连作2、4、8 a 的地块随机选取4 株健康烟株和4 株根腐病发病较重的烟株，连作年限编号分别为T2、T4、T8。取样时去除地表杂物，然后将烟株整株挖起，去除主体根围土，采用抖根法[16‑17]收集须根2 mm 范围内的土壤。3 种连作年限（2、4、8 a）烟田中，病株根际土壤组（S）样本编号分别为ST2、ST4、ST8，健株根际土壤组（H）样本编号分别为HT2、HT4、HT8。同时，在相同区域取撂荒2 a 以上地块（未种植任何作物）0～20 cm 土层土壤，样品编号为CK。用于化学性质检测的土壤样品用自封袋装好，带回实验室，自然阴干，研磨过筛后备用；用于细菌、真菌高通量测序的土壤样品用取样管装好置于低温保藏箱，快速带回实验室于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 检测项目及方法

1.2.1 土壤化学性质的测定 土壤样本的有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量和pH 值测定参照文献[18]的方法进行。

1.2.2 土壤细菌、真菌高通量测序

1.2.2.1 DNA 提取 采用HiPure Soil DNA Mini Kit试剂盒（Magen，广州，中国，cat#3412）进行土壤微生物DNA 提取。首先在2 mL beads Tube 中加入0.25～0.50 g 土壤样品和0.6 mL Buffer SOL，利用涡旋仪（米欧mix-28+，广州围谷润仪器有限公司）充分匀浆裂解，然后70 ℃水浴10 min，并离心收集管壁上液 滴，加 入200 μL Buffer PS 和150 μL Absorber Solution，涡旋混匀20 s，静置5 min 后离心5 min，取上清液至2 mL 离心管，加入等体积Buffer GDP，混匀，获得DNA 后，用1%琼脂糖（Biowest Agarose，西班牙）凝胶电泳（DYY-6C，北京六一仪器厂）检测基因组DNA 的完整性和是否发生蛋白质等污染，DNA样品于-80 ℃保存待用。

1.2.2.2 目的基因扩增及I llumina 测序 采用带有Barcode 标 记 的 特 异 引 物 341F （5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）、806R（5′-GGACTA‑CHVGGGTATCAAT-3′）对细菌16S rDNA V3—V4区进行MiSeq 扩增子测序;采用带有Barcode 标记的特异引物ITS3-F（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）、ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对真菌ITS 的ITS2 测序区域进行MiSeq 扩增子测序。PCR 采 用TransStart Fastpfu DNA Polymerase 聚 合酶，每个样本3 次PCR 重复，扩增后将PCR 产物利用AMPure XP 磁珠进行纯化，混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。第2 轮扩增后使用AMPure XP 磁珠对PCR 产物进行纯化，之后用ABI StepOnePlus RealTime PCR System（Life technologies，美国）进行定量，最后根据Novaseq 6000的PE250模式Pooling上机测序。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2016 进行数据处理，用IBM Statistics SPSS 20.0 进行方差分析。利用软件平台Usearch（version 7.0）对相似度在97%条件下的操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU）进行质控拼接和Tag 聚类去嵌合体，获得OTU 的丰度和OTU 代表序列。利用软件Mothur（v.1.30.1）计算反映群落丰富度（Community richness）的Sobs 指数、Chao1 指数以及反映群落多样性的Shannon-Wiener指数（香农-维纳指数），分析其α 多样性。利用主坐标分析（Principal co‑ordinate analysis，PCoA）法进行β 多样性分析，并结合Anosim 检验分析不同样本细菌、真菌群落差异。采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）进行环境因子与微生物群落分布的关联分析。

2 结果与分析

2.1 连作烟田健株和根腐病感病烟株根际土壤细菌、真菌群落组成分析

细菌属水平上，排前10位的优势细菌属相对丰度累积总和达到19.9%～29.8%。相较于CK，HT2、HT4、HT8 样本排前10 位的优势细菌属相对丰度增幅分别为9.2%、29.5%、24.2%，ST2、ST4、ST8 样本相对丰度增幅分别为26.4%、27.2%、29.8%（图1a）。从图1a 丰度热图可以看出，相较于CK，HT2、HT4、HT8 样本优势细菌属中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）相对丰度增幅分别为-19.6%、16.2%、47.6%，芽单胞菌属（Gemmatimonas）相对丰度增幅分别为82.9%、188.1%、225.9%，弗拉托氏菌属（Frateuria）相对丰度增幅分别为865.4%、934.6%、330.8%，出芽菌属（Gemmata）相对丰度增幅分别为92.6%、113.0%、250.0%；ST2、ST4、ST8 样本优势细菌属中鞘氨醇单胞菌属相对丰度增幅分别为-23.1%、50.3%、63.4%，芽单胞菌属相对丰度增幅分别为52.8%、160.1%、200.0%，弗拉托氏菌属相对丰度增幅分别为1 123.1%、350.0%、150.0%，出芽菌属相对丰度增幅分别为7.4%、203.7%、418.5%。另外，ST4 和HT8 样本的戴氏菌属（Dyella），ST4、HT8、ST8 样 本 的 小 梨 形 菌 属（Pirellula）和Candidatus_Udaeobbacter菌属相对丰度较高。

真菌属水平上，排前17位的优势菌属相对丰度累积总和达到19.0%～67.8%（图1b）。相较于CK，HT2、HT4、HT8 样本优势真菌属相对丰度累积总和降幅分别为53.4%、53.7%、65.7%；ST2、ST4、ST8 样本优势真菌属相对丰度累积总和降幅分别为19.0%、51.9%、67.8%。相较于CK，HT2、HT4、HT8样本的青霉菌属（Penicillium）相对丰度降幅分别为72.2%、 86.0%、 95.0%， 淡 紫 紫 孢 菌 属（Purpureocillium）相对丰度降幅分别为90.9%、83.9%、39.5%，毛壳菌属（Chaetomium）相对丰度降幅分别为47.5%、26.1%、76.3%；HT4 和HT8 样本镰刀菌属（Fusarium）相对丰度增幅分别为430.3%、576.8%，HT2 样本降幅为59.5%。相较于CK，ST2、ST4、ST8 样本的青霉菌属相对丰度降幅分别为66.4%、92.8%、97.4%，而镰刀菌属相对丰度增幅分别为255.8%、123.4%、389.3%；ST2 样本木霉菌属相对丰度增幅为530.3%，而ST4、ST8 样本木霉菌属相对丰度降幅分别为30.3%、51.5%；ST2和ST8样本淡紫紫孢菌属降幅分别为96.5%和79.7%，ST4样本增幅为23.1%；毛壳菌属等其他几种优势菌属相对丰度变化规律不明显。相较于其他处理，连作8 a 烟田健株和病株根际土壤以链格孢属（Alternaria）、头束霉属（Cephalotrichum）相对丰度较高，且ST8 样本尾柄孢壳属（Cercophora，相对丰度2.77%）和Setophoma属（2.30%）相对丰度也较高。

图1 连作烟田健株和根腐病感病烟株根际土壤细菌（a）、真菌（b）属水平上物种丰度热图Fig.1 Heat map of bacterial（a）and fungal（b）relative abundance in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field at genus level

2.2 连作烟田健株和根腐病感病烟株根际土壤细菌、真菌群落的α多样性分析

Sobs 指数表示实际检测到的OTU 个数，反映样本物种丰富程度，Shannon-Wiener 指数综合反映物种的多样性和均匀度，Shannon-Wiener 指数越大，样本物种分布越均匀，多样性越高。从不同连作年限烟田健株和病株根际土壤细菌、真菌群落的α 多样性（表1）可以看出，随连作年限的延长，细菌群落Sobs 指数和Chao1 指数整体呈增大趋势，除连作4 a烟田病株根际土壤细菌群落Sobs指数和Chao1指数大于健株外，连作2 a 和8 a 烟田均表现为病株根际土壤细菌群落Sobs 指数略低于健株，表明连作年限增加，土壤细菌群落丰富度增加，感病烟株根际土壤细菌群落丰富度在一定程度上降低。细菌Shannon-Wiener 指数随连作年限的延长呈增大趋势，以连作8 a 烟田的健株和病株样本较高，其中连作4 a 和8 a 烟田均表现为病株样本略高于健株样本，连作2 a 烟田则表现为病株样本小于健株样本，表明长期连作（4～8 a）提高烟株根际土壤细菌群落多样性，感病对烟株根际土壤细菌群落多样性的增加有一定的促进作用。相较于CK，随连作年限的延长，烟田健株和病株根际土壤真菌群落Sobs 指数、Chao1 指数和Shannon-Wiener 指数整体呈先降后升的趋势，除连作2 a 烟田外，连作4 a 和8 a 烟田病株样本真菌群落Sobs 指数均大于健株；连作2 a 和4 a烟田健株样本Shannon-Wiener 指数低于病株，连作8 a烟田病株样本Shannon-Wiener指数略低于健株；Chao1指数均表现为病株样本大于健株样本。

表1 连作烟田健株与根腐病感病烟株根际土壤细菌和真菌群落α多样性Tab.1 α-diversity of bacterial and fungal communities in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field

2.3 连作烟田健株和根腐病感病烟株根际土壤细菌、真菌群落的β多样性分析

PCoA 基于距离矩阵进行降维分析，以百分比评估各坐标轴对菌群结构总体差异的解释度，一般PCoA1和PCoA2总和达到50%以上较好。从图2可以看出，细菌的PCoA1 与PCoA2 总和为56.32%，真菌的PCoA1 与PCoA2 总和为50.31%，均大于50%，说明坐标轴对细菌、真菌群落结构总体差异解释度较好。不同连作年限烟田的健株及病株根际土壤样本生物细菌、真菌群落组成差异较大，相同连作年限烟田的健株和病株根际土壤样本的细菌、真菌群落组成差异较小。连作年限越长，距离CK 土壤样本越远。Anosim检验结果表明，除HT2和ST2样本的真菌群落组成有显著差异（P<0.05）外，其余相同连作年限烟田的健株和病株根际土壤细菌、真菌群落组成无显著差异（P>0.05），说明群落结构相似性较高，但与CK 样本差异均达到显著水平（P<0.05）。随连作年限的延长，CK、HT2、HT4 及HT8样本间，以及CK、ST2、ST4 及ST8 样本间细菌、真菌群落组成差异均达到极显著水平（P<0.01）。

图2 连作烟田健株和根腐病感病烟株根际土壤细菌（a）、真菌（b）OTU的β多样性Fig.2 β-diversity analysis of bacterial（a）and fungal（b）OTUs in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field

2.4 连作烟田健株和根腐病感病烟株根际土壤化学性质与微生物群落关联分析

2.4.1 连作烟田健株和病株根际土壤的化学性质

从表2 可以看出，撂荒土壤（CK）养分含量均显著（P<0.05）低于其他处理，尤其是速效磷、速效钾和有机质含量较低，其中HT2、HT4、HT8 处理根际土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量分别较CK增加102.8%～336.4%、71.0%～108.3%、96.8%～703.2%、124.5%～233.3%，ST2、ST4、ST8 处理根际土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量分别较CK 增加101.9%～233.6%、66.7%～158.3%、306.3%～793.7%、125.1%～234.4%，说明健株和病株根际土壤主要养分变化特征相似，但病株根际土壤养分水平整体优于健株根际土壤，这可能与烟株感病后养分吸收水平降低有关。

表2 连作烟田健株和根腐病感病烟株根际土壤的化学性质Tab.2 Chemical properties of rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in different continuous cropping fields

2.4.2 土壤化学性质与细菌、真菌性状关联特征

RDA 主要通过降维思想，使用二维平面反映菌群、样本、环境因子三者之间的关系。从图3可以看出，属水平上，不同连作年限烟田健株和病株根际土壤细菌（图3a）、真菌（图3b）RDA分析的第Ⅰ和第Ⅱ排序轴5 个环境因子累积解释变异量分别达到82.01%、89.84%，说明前2 个排序轴能够很好地反映土壤细菌、真菌群落结构与土壤化学性质之间的关系，且主要由第Ⅰ轴决定。

图3 细菌（a）、真菌（b）群落与土壤化学性质的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis between bacterial（a），fungal（b）communities and soil chemical properties

在细菌属水平上（图4a），皮尔森（Pearson）相关系数表明，土壤pH 值与鞘氨醇单胞菌属、Candidatus_Udaeobacter、出芽菌属相对丰度呈极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）正相关，与链霉菌属、Bryobacter、Granulicella、JG30a-KF-32、酸 杆 菌 属（Acidibacter）和Singulisphaera相对丰度呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）负相关；土壤有机质含量仅与Occallatibacter相对丰度呈显著负相关（P<0.05）；土壤碱解氮含量与出芽菌属、Candidatus_Udaeobacter和小梨形菌属相对丰度呈极显著（P<0.01）或 显 著（P<0.05）正 相 关，与Granulicella、JG30a-KF-32、Occallatibacter、酸杆菌属相对丰度呈极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）负相关；土壤速效磷含量与小梨形菌属、Singulisphaera、Candidatus_Udaeobacter和出芽菌属相对丰度呈极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）正相关；土壤速效钾含量与芽单胞菌属、出芽菌属、Candidatus_Udaeobacter和小梨形菌属相对丰度呈极显著正相关（P<0.01），与Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Granulicella、细 链 孢 菌 属（Catenulispora）、JG30a-KF-32、Occallatibacter、酸杆菌属相对丰度呈极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）负相关。在真菌属水平上（图4b），皮尔森（Pearson）相关系数表明，土壤pH 值与青霉菌属、Oidiodendron相对丰度呈显著负相关（P<0.05）；土壤有机质含量与Setophoma相对丰度呈显著负相关（P<0.05），与Oidiodendron呈显著正相关（P<0.05）；土壤碱解氮含量与青霉菌属相对丰度呈显著负相关（P<0.05），与链格孢属（Alternaria）呈显著正相关（P<0.05）；土壤速效磷含量与青霉菌属、毛壳菌属相对丰度呈显著负相关（P<0.05）；土壤速效钾含量与青霉菌属相对丰度呈极显著负相关（P<0.01）。

图4 土壤化学性质与细菌（a）、真菌（b）群落的皮尔森分析Fig.4 Pearson analysis between soil chemical properties and bacterial（a），fungal（b）communities

几种主要化学指标中以土壤速效钾含量和pH值对细菌群落分布影响较大，贡献值分别为8.80%和8.62%（图5a），以速效磷含量对真菌群落分布影响最大，贡献值为11.64%（图5b）。说明pH 值和速效钾含量是影响细菌群落分布的核心化学因子，速效磷含量是影响真菌群落分布的核心化学因子。

图5 土壤化学性质对细菌（a）、真菌（b）分布的贡献度分析Fig.5 Contribution of soil chemical properties to the distribution of bacteria（a）and fungi（b）

3 结论与讨论

3.1 连作与根腐病感染对烟株土壤微生物群落结构的影响

本研究发现，烤烟连作与感病条件下，烟田土壤微生物种群结构发生趋向性变化，优势种群累积特征明显。细菌优势菌群相对丰度累积总和随连作年限的延长总体呈增加趋势，与CK 相比，健株、病株排前10 位的优势菌属相对丰度累积总和增幅分别为9.2%～29.5%、26.4%～29.8%，其中以芽单胞菌属、弗拉托氏菌属、出芽菌属相对丰度增幅较大，连作4 a 烟田病株和连作8 a 烟田健株及病株根际土壤样本中常见致病病原菌小梨形菌属和Candidatus_Udaeobbacter相对丰度也较高。

真菌优势菌属相对丰度累积总和随连作年限的增加呈降低趋势，与CK 相比，健株、病株根际土壤优势菌属相对丰度累积总和降幅分别为53.4%～65.7%、19.0%～67.8%，其中健株根际土壤样本以青霉菌属、淡紫紫孢菌属和毛壳菌属降幅较大，连作4 a和连作8 a样本镰刀菌属相对丰度增幅较大。病株根际土壤以青霉菌属相对丰度降幅较大，以镰刀菌属相对丰度增幅较大，说明青霉菌属和镰刀菌属是造成连作烟田健株和根腐病感病烟株根际土壤群落差异的关键物种。与丁亚茹等[19]研究指出一些关键物种是造成健康和易感烟田根际土壤微生物群落差异的主要原因结论一致。DAGUENRE 等[20]研究也认为，几乎每一种土传病原微生物都有与之相克的拮抗微生物。已有研究报道显示，青霉属真菌中已报道了1 300 多种不同的代谢产物，它们普遍具有抗菌、抗虫等活性[21]。前人已分离出大量对病原菌具有较好抑制效应的青霉属真菌[22]。淡紫紫孢菌是一种重要的生防菌，在根结线虫防治方面有广泛应用[23‑25]；毛壳菌对许多植物病原菌有潜在的生 防 作 用[26‑27]，其 中 内 生 球 毛 壳 菌（Chaetomium globosum）对油菜菌核病病原菌和立枯丝核菌具有不同程度的抑制作用[28]。镰刀菌属为重要的土传病原菌[29‑30]，常引起作物根腐病[31‑33]，本研究结果显示，不同连作年限烟田健株和病株根际土壤镰刀菌属相对丰度整体增幅较大，推测其可能是引起试验烟株发生根腐病的主要病原。综上所述，连作提高土壤细菌优势菌种群丰富度，降低土壤真菌优势菌种群丰富度，表现为病原菌丰度增加，拮抗菌丰度降低，该试验连作烟田烤烟受根结线虫病和镰刀菌根腐病等土传病害侵染危害风险较高。

3.2 连作与根腐病感染对土壤细菌、真菌群落多样性的影响

土壤微生物的数量、种类和多样性是维持土壤健康和质量的重要因素[34]。土壤连作障碍的发生与土壤微生物的种类和数量变化有着密切关系[35]。本研究中，随连作年限延长，健株和病株根际土壤真菌群落的Sobs 指数、Chao1 指数和Shannon-Wiener指数均呈先降后升的变化趋势，但总体上均小于CK样本。

健株根际土壤细菌群落丰富度随连作年限增加呈增加趋势，病株除ST4 样本的细菌群落丰富度大于HT4 外，ST2 和ST8 样本的细菌群落丰富度均小于相应连作年限的健株，其原因可能与连作4 a烟田病株的异质性有关；健株和病株样本的细菌群落多样性随连作年限的延长而提高，其中连作4 a和8 a 烟田的病株样本均大于健株；健株和病株根际土壤细菌群落Sobs、Chao1 和Shannon-Wiener 指数均大于CK，说明连作烟田土壤细菌群落丰富度和多样性提高，但长期连作条件下烟株感染根腐病后细菌群落的丰富度降低但群落多样性提高，与文献[34‑37]认为烤烟连作减少土壤细菌多样性、增加真菌数量的结论不完全一致。这可能与连作地块在肥料[38]、调理剂[39]施用等方面存在差异有关。本研究中，主坐标分析和Anosim 检验结果表明，不同连作年限烟田健株样本间及病株样本间根际土壤样本细菌和真菌群落组成差异较大，且连作年限越长，与撂荒土壤细菌、真菌群落组成差异越大。

3.3 连作烟田理化性质对健康和感病烟株根际微生物分布的影响

连作条件下，健康和病株根际土壤细菌、真菌群落分布与土壤化学性质的关系存在差异，其中土壤pH 值和速效钾含量对细菌群落的分布影响较大，这与文献[3]的结论一致，土壤速效磷含量对真菌群落的分布影响较大。本研究中，土壤pH 值与鞘氨醇单胞菌属、Candidatus_Udaeobacter、出芽菌属相对丰度呈极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）正相关，与链霉菌属、Bryobacter、Granulicella、JG30a-KF-32、酸杆菌属（Acidibacter）、Singulisphaera、青霉菌属和Oidiodendron的相对丰度呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）负相关，其中链霉菌、酸杆菌、青霉菌为常见的有益菌，说明调控pH 值对维持土壤有益菌和病原菌平衡至关重要。另外，土壤速效钾含量与酸杆菌属和青霉菌属相对丰度呈显著负相关，而与小梨形菌属相对丰度呈正相关，说明增施钾肥降低有益菌群丰度，增加特殊病原菌群丰度，这可能与近年来烤烟种植时大量施用钾肥有关。矿质营养不仅对植物正常生长发育起重要作用，而且以多种方式直接或间接影响病原物的侵染、繁殖及植株的感病与抗病性[40]。可见，通过调控土壤理化性质尤其是pH 值，可以调控土壤微生物群落结构及分布，这与刘株秀等[41]的研究结果一致。