丹参、泽泻对NAFLD大鼠脂代谢及PPARα基因表达的影响*

石家庄医学高等专科学校

路 帅 郭建利 彪雅宁△ 陈 健△ 石 铖△ 韩 雪△ (石家庄 050599)

提要 目的：探究丹参、泽泻对非酒精性脂肪肝(NAFLD)的可能作用机制。方法：将60只Wista大鼠随机分为6组：正常组、模型组、东宝甘泰组和丹参水煎剂组、泽泻水煎剂组、丹参-泽泻(丹泽)水煎剂组。通过喂饲高脂饲料建立NAFLD模型，同时给予相应药物治疗。8周后，检测各组大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平及过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)mRNA表达，HE法观察大鼠肝组织病理形态学改变。结果：各用药组均能明显改善血脂和肝功能 (P<0.01)，升高肝组织PPARα mRNA的表达(P<0.01)，尤以丹泽组降脂作用更为明显。结论：丹参、泽泻和丹泽水煎剂能显著改善NAFLD大鼠脂代谢紊乱，改善肝功能，其机制可能与增强肝组织中PPARα mRNA表达有关。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精和其他明确损肝因素外所致的以肝细胞呈现较大空泡性脂肪变性和脂肪大量蓄积为基本特征的病理综合征[1]。近年来随着人们生活水平提高，NAFLD发展迅速，且发病趋于年轻化，在我国患病率约为15.0%，已成为我国第一大慢性肝病[2-3]。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是核受体超家族成员中由配体激活的核转录因子，有过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)、PPAR-β/δ和PPAR-γ3种亚型，其中， PPARα对白色和褐色脂肪代谢有直接或间接的调节作用，促进能量与脂肪的代谢，进而减少脂质沉积[4-6]。研究表明， NAFLD大鼠采用PPARα激动剂干预后，大鼠血脂和肝功能得到明显改善[7]。

目前临床治疗NAFLD仍是以调整生活方式为主，缺乏特异性治疗药物。现代医家多选用减肥药、调脂药、胰岛素增敏剂、抗氧化剂等药物，但长期服用会加重患者肝脏负担，导致肌毒性、足部水肿、充血性心力衰竭而限制了临床应用[8]。近年报道表明，中医药治疗NAFLD疗效显著，且毒副作用较小，在缓解慢性肝病、减少脂质增生方面具有独特的作用。

丹参活血祛瘀，可改善肝脏微循环，扩张血管，抗肝纤维化，对肝脏有保护作用[9]；泽泻利水渗湿、化浊降脂，其提取物及其萜类成分具有调血脂、抗动脉粥样硬化等作用[10]。笔者在查阅中医药治疗NAFLD的用药规律相关文献发现，丹参、泽泻为治疗NAFLD用药频率最高的前2名[11]，故本研究采用丹参-泽泻治疗NAFLD模型大鼠，观察脂代谢、肝功能指标及PPARα mRNA表达，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物 丹参、泽泻饮片购自河北省石家庄市乐仁堂药店，水煎然后浓缩至所需浓度；东宝甘泰片(批号：090504)用0.5%的羧甲基纤维素钠配制；胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)试剂盒均购于北京中山生物技术有限公司。

1.2 动物与分组 60只SPF级Wista大鼠，雄性，体质量为200～220 g，购自河北医科大学实验动物中心，合格证号为1003046。适应性喂养7 d，按体质量随机分为6组：正常组(C)、模型组(M)、丹参水煎剂组(S，5 g/kg)、泽泻水煎剂组(R，3.33 g/kg)、丹参-泽泻(丹泽)水煎剂组(SR，8.33 g/kg)、东宝甘泰组(DBGT，1.25 g/kg)。每组10只。

1.3 造模与给药 正常组大鼠喂饲普通饲料，其余各组均喂饲高脂饲料[9](配方：88%基础饲料+10%猪油+1.5%胆固醇+0.5%胆盐)，由河北医科大学实验动物中心加工。造模同时，给药组给予相应药物治疗，正常组和模型组灌胃等量蒸馏水，每日1次，给药体积为1 mL/100 g，连续8周。

1.4 标本采集 于最后1次灌胃后，禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉大鼠，股主动脉取血于试管中，离心分离血清，冷贮以备血清指标检测；迅速剖取1份适宜大小肝组织用4%多聚甲醛固定以备病理形态学的观察；另取1份肝组织于冻存管中以备肝组织PPARα mRNA检测。

1.5 指标检测

1.5.1 血脂测定：酶法测定血清中TG、TC、FFA的含量，以上操作均严格按试剂盒说明进行。

1.5.2 肝功能测定：赖氏法测定血清中AST、ALT的活性，以上操作均严格按试剂盒说明进行。

1.5.3 HE染色观察肝脏病理形态学：经甲醛处理的肝组织进行常规脱水、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察染色结果。

1.5.4 RT-PCR法检测：检测肝组织PPARα mRNA的表达 Trizol法提取总RNA，引物序列由primer5.0软件设计，实验重复3次，以β-actin为内参计算相对含量。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂的变化情况 模型组大鼠血脂含量明显高于正常组和用药组(P<0.01)，其中，泽泻及丹泽水煎剂组血清TG含量明显低于东宝甘泰组 (P<0.01)，丹参、泽泻及丹泽水煎剂组血清FFA含量明显均低于东宝甘泰组(P<0.01)，差异均有非常显著性。详见表1。

表1 各组大鼠血清TC、TG和FFA含量的组间比较

2.2 各组大鼠血清ALT和AST的活性变化 模型组大鼠血清ALT和AST的活性明显高于正常组和给药组(P<0.01)，其中，丹参、泽泻及丹泽水煎剂组ALT活性均显著低于东宝甘泰组(P<0.01)，丹泽水煎剂组AST活性明显低于东宝甘泰组(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血清ALT和AST活性的组间比较

同项比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 各组大鼠肝组织PPARα mRNA的表达 模型组大鼠肝组织PPARα mRNA的表达明显低于正常组和给药组(P<0.01)，东宝甘泰组、丹参组和泽泻组中PPARα mRNA的表达明显低于丹泽组(P<0.01)。见图1、图2。

注：与模型组比较，** P<0.01；与东宝甘泰组比较，##P<0.01。

注：1.C组；2.M组；3.S组；4.R组；5.SR组；6.DBGT组。

2.4 各组大鼠肝组织病理形态学改变 正常组大鼠肝组织结构清晰，肝细胞排列整齐，无脂肪变性。模型组大鼠肝细胞出现水肿，脂滴空泡多见，各给药组可改善肝脏脂肪变性。

3 讨论

NAFLD患者通常无显著特征，部分患者表现为全身乏力、腹部胀满、肝区隐痛、右上腹不适或胀满感等症状，中医学根根据NAFLD的临床表现将其归属于 “胁痛”“积聚”“痰浊”“血瘀”等范畴。项目组认为NAFLD多由于过食精肥甘甜、所欲不遂、怠惰懒动等致脾运失职，水湿内停，聚而为痰；肝失疏泄，气机不畅，血脉瘀阻，终致痰瘀互结于肝而发为本病。故肝脾失调、痰瘀互结为其主要病机，化痰祛瘀、健脾调肝为相应治则。现代药理表明，丹参酮ⅡA可调节高脂血症大鼠PPAR信号通路，以保护肝脏[12]；丹参酮ⅡA的水溶性衍生物—丹参酮ⅡA磺酸钠可通过提高高脂血症大鼠的抗氧化能力，进而降低血脂[13]；泽泻的醇提物、水提物均能显著降低高脂血症大鼠血脂水平[14-15]；泽泻醇提取物可通过调节肠道菌群的结构调节脂质代谢[16]。因此，本研究选用丹参和泽泻配伍，探讨丹参-泽泻对NAFLD大鼠的治疗作用及其机制。

脂质代谢的重要部位是肝脏，长期高脂饮食，大量的FFA从脂肪组织释放或由肠道吸收直接入血，血中FFA增加，同时肝脏也沉积大量FFA，与胆固醇脂滴结合为TG，导致肝内TG增多[17]。肝脏有一定限度转运TG的能力，当合成的量超过这个限度就造成脂肪的蓄积，形成脂肪肝。NAFLD常伴随着肝损伤，ALT、AST为评价肝损伤的“金指标”，能反应肝细胞损伤及程度[18-19]。当肝细胞受损或坏死时，细胞膜通透性增加，ALT、AST会透过细胞膜释放入血，使得血清中ALT和 AST活性急剧升高。

PPARα属于新型甾体类激素受体，有468个氨基酸残基，在肝脏、脂肪组织中高度表达。最新研究表明，PPARα具有调节脂代谢作用，进而干预NAFLD的发生和发展。NAFLD患者的外周血单个核细胞中PPARα表达高于正常人的2.03～3.31倍, 且肝脏中PPARα mRNA表达水平与NASH严重程度呈负相关[20-21]。当PPARα活化，脂肪酸的氧化作用加强，胰岛素敏感性也增加，进而影响NAFLD的进展。PPARα调节脂质代谢的作用涉及以下几个方面：(1)通过增加脂蛋白脂肪酶的活性，加速TG分解；(2)促进脂肪酸的β氧化[22-23]；(3)通过作用于HDL受体，增加TC的转运；(4)通过降低中性脂质在VLDL和HDL之间的交换，加速LDL的清除[24]。此外，PPARα还可以抑制炎症反应的相关信号通路，进而缓解NAFLD[25]。

本实验结果证明，长期喂养高脂饮食可使大鼠血脂含量升高，肝功能受损，肝细胞出现脂肪变性，肝组织PPARα mRNA表达水平降低；而各给药组血清TG、TC、FFA、AST和ALT含量或活性较模型组明显降低，肝组织PPARα mRNA表达升高，肝脏脂肪变性减轻，提示丹参、泽泻能够改善肝功能，调节血脂代谢，其机制可能与调控PPARα的基因表达、加速脂肪氧化分解有关。