蓝桉实生瓶苗繁育技术体系的建立

李 艳， 耿金凤， 曹现富， 邹广权， 曹子林， 王晓丽

(1.西南林业大学林学院， 云南 昆明 650224； 2.西南林业大学生态与环境学院， 云南 昆明 650224)

蓝桉(EucalyptusglobulusLabill.)生长迅速，经营周期短，是桉树中少有的油、材兼用树种，经济价值显著[1-3]，在云南省较早引种栽植和分布[3]。目前蓝桉人工林培育的材料来源主要是种子和实生苗，但良种资源少，种源不足，导致种子价格畸高且种苗质量良莠不齐，造林后林木分化明显[4-6]。因此，蓝桉良种无性快繁技术体系的构建成为解决该问题的关键。组培以其生产效率高等特点成为林木良种快繁的主要技术之一[7]。外植体的来源和质量是组培成败的关键因素之一，室外和开放环境下的外植体由于带菌严重，导致组培过程中污染严重，提高了组培的成本[8-9]。蓝桉超级苗组培快繁技术体系研究中，以室外栽植的实生超级苗的半木质化茎段为外植体，接种后外植体的污染率高达43.88%[10]。健壮的实生瓶苗本身是无菌的，可以从源头上控制组培过程中的污染，降低组培的成本，因此，健壮实生瓶苗的培育是蓝桉高效组培技术体系构建的基础和关键，但目前未见其相关研究报道。

pH值为5.0～8.0时，琼脂浓度是影响固体培养基凝固等级的重要因素，琼脂量过多，培养基较硬，不利于种子坐落，且种子和幼苗难以吸收培养基中的营养物质；琼脂量过少，培养基较稀，不能很好固化[11]。固体培养基的琼脂浓度对植物繁育影响研究主要集中在植物组培体系构建方面[10，12-14]，崔广荣等[14]研究表明，随着琼脂浓度的增大，文心兰(Oncidiumhybridum)芽诱导时间延长，增殖数量下降，当琼脂用量达到6.0 g/L时，有较多的根形成。目前未见植物实生瓶苗繁育中固体培养基的琼脂浓度对种子萌发和幼苗生长影响的相关研究报道。

适宜的外源激素处理，可打破种子休眠、促进种子萌发[15-16]。令狐昱慰等[17]用添加不同浓度GA3、6-BA和IBA的MS培养基，对山白树(Sinowilsoniahenry)种子进行无菌培养，发现外源激素GA3、6-BA和IBA均可提高山白树种子的发芽率和幼苗的生长速率；一定浓度的GA3显著促进种子萌发；一定浓度的6-BA在促进种子萌发的同时，还可促进胚根的伸长和侧根数量的增多。Zhai等[18]以梧桐(Firmianasimplex)种子为试材，研究不同浓度GA3、水杨酸和NAA对梧桐幼苗生长的影响，发现0.05 g/L和0.075 g/L的NAA可分别显著促进幼苗主根和主茎的生长。外源激素调控蓝桉实生瓶苗培育的研究未见报道。

本研究以蓝桉种子为试材，采用3因素5水平的均匀试验设计，探讨琼脂用量和外源激素(6-BA和NAA)浓度对蓝桉实生瓶苗培育的影响效应，筛选试验最佳处理组合和理论最优处理组合，构建蓝桉实生瓶苗培育的技术体系，以期获得健壮无菌的实生瓶苗，为蓝桉组培技术体系的构建提供充足且理想的外植体材料来源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蓝桉种子采自昆明呼马山的蓝桉人工林，采种母树年龄30年左右，生长健壮，干形通直。

1.2 研究方法

参考杜永光等[12]、黄迪等[13]、令狐昱慰等[17]和Zhai等[18]的方法并根据蓝桉种苗培育的特点加以调整，以MS培养基为基础培养基(pH=5.8)，采用3因素(琼脂、NAA和6-BA浓度)5水平(选用均匀设计表U5(53)和其配套的使用表完成本试验设计)的均匀试验设计(表1和表2)，筛选蓝桉实生瓶苗培育的试验最佳处理组合，分析其主导因素和理论最优处理组合。本试验共计5个处理组合，每个处理组合3个重复，每个重复10瓶，每瓶接种5粒蓝桉种子。

表2 蓝桉实生瓶苗培育均匀试验Table 2 Uniform design of experiment for obtaining of aseptic seedlings of E. globulus

试验所用的培养基、镊子、双纯水、吸水纸等均需121 ℃高压灭菌20 min；超净工作台先喷75%酒精，而后紫外线照射30 min灭菌。将蓝桉种子置于流水下冲洗30 min，然后沥干水分，把种子放入超净工作台上，先用75%的酒精消毒15 s，再用0.1%的升汞消毒2 min，最后用无菌水清洗6次，备用。取少量种子平铺于吸水纸上以吸收种子外表多余水分，然后将种子接种于培养瓶中。接种当天为第1天，30 d时记录种子发芽数，计算发芽率；60 d时，将幼苗整株从培养基中取出，测定幼苗的苗高(用直尺测量从幼苗胚轴处至最高处的距离)、地径(用游标卡尺测量幼苗胚轴上方茎的直径)、主根长(用直尺测量从幼苗胚轴处至主根根尖的距离)及鲜重(用千分之一天平称量幼苗的重量)，每个处理组合每个重复随机取10株幼苗。

1.3 数据的统计与分析

通过Excel 2007软件进行数据整理，利用SPSS 17.0软件对5个处理组合蓝桉种子的发芽率和幼苗的苗高、地径、主根长以及鲜重分别进行描述统计分析、方差分析和回归分析[19]，从而获得最优试验处理组合、回归方程、因素的主次顺序、理论最优处理组合及其相应测定指标效果,进而得到经济有效的处理或处理组合用于指导蓝桉实生瓶苗的培育。

2 结果与分析

2.1 不同处理组合对蓝桉种子萌发和幼苗生长影响的描述统计分析

由表3可知，5种处理组合对蓝桉种子的发芽率和幼苗的苗高、地径、主根长以及鲜重等测定指标的具体影响程度虽然不同，但其效应规律基本一致，即每个测定指标的不同处理组合间的极差均较大(极差/均值最小为41.07%，最大为116.99%)，认为试验处理对测定指标的作用效应明显。5个处理组合中，处理组合3的蓝桉种子发芽率最大(66.42%)，处理组合4的发芽率次之(64.10%)；处理组合4的蓝桉幼苗的苗高(14.333 cm)、地径(9.820 mm)、主根长(6.954 cm)和鲜重(2.101 g)皆最大。5个处理组合中，处理组合3和处理组合4的发芽率皆大于其均值(53.93%)；仅处理组合4的苗高大于其均值(9.351 cm)；处理组合4和处理组合5的地径皆大于其均值(5.736 mm)；处理组合3、4和处理组合5的主根长皆大于其均值(5.530 cm)；处理组合4和处理组合5的鲜重皆大于其均值(1.471 g)。从描述统计分析角度来看，处理组合3(A3B1C2)、4(A4B3C1)和5(A5B5C5)对蓝桉种子萌发和幼苗生长的促进效果较好。

表3 各处理组合对蓝桉种子萌发和幼苗生长影响的描述统计分析和方差分析Table 3 Descriptive statistical analysis and variance analysis of the effects of different treatment combinations on the seeds germination and seedlings growth of E. globulus

2.2 不同处理组合对蓝桉种子萌发和幼苗生长影响的方差分析

由表3可知，不同处理组合对种子发芽率(p=0.035)及幼苗苗高(p=0.000)、地径(p=0.000)、主根长(p=0.044)和鲜重(p=0.016)5个测定指标均具不同效应；不同处理组合对苗高和地径皆具极显著差异，不同处理组合对发芽率、主根长和鲜重皆具显著差异。多重比较结果(表3)表明，处理组合3和处理组4的发芽率均显著大于处理组合1、2和处理组合5，处理组合3和处理组合4间无显著差异，处理组合1、2、5两两间亦无显著差异；处理组合4的苗高极显著大于其他4种处理组合，处理组合3和处理组合5的苗高均极显著大于处理组合1，处理组合2为过渡组；处理组合4的地径极显著大于处理组合1、2和处理组合3，处理组合4和处理组合5间无极显著差异，处理组合5和处理组合3间亦无极显著差异，处理组合3极显著大于处理组合1，处理组合2为过渡组；处理组合3和处理组合4的主根长均显著大于处理组合1和处理组合2，处理组合3和处理组合4间无显著差异，处理组合1和处理组合2间亦无显著差异，处理组合5为过渡组；处理组合4的鲜重显著大于处理组合1、2和处理组合3，处理组合4和处理组合5间无显著差异，处理组合5和处理组合3均显著大于处理组合2，处理组合1为过渡组。从方差分析和多重比较角度来看，利于蓝桉种子萌发的优处理组合为处理组合3和处理组合4；利于幼苗生长的优处理组合为处理组合3、4和处理组合5；既利于种子萌发又利于幼苗生长的试验最优处理组合为处理组合4(A4B3C1)。

2.3 不同处理组合对蓝桉种子萌发和幼苗生长影响的回归分析

由表4、表5可知，5个测定指标(发芽率、苗高、地径、主根长和鲜重)均求得其相应的回归方程；从方差分析结果可以看出，所求的5个回归方程均显著(苗高、地径和鲜重的3个方程极显著，发芽率和主根长的2个方程显著)，因此该5个回归方程是可信的；5个回归方程的R值为0.762～0.878，说明测定指标与试验因素相关性较高，回归方程的拟合度较好；由发芽率回归方程的系数及其p值可知，C因素(p=0.703)不能引入发芽率回归方程，由标准偏回归系数可知因素的主次顺序为B(5.410)>A(2.852)>C(1.271)；由苗高回归方程的系数及其p值可知，C因素(p=0.552)不能引入苗高回归方程，由标准偏回归系数可知因素的主次顺序为B(4.033)>A(2.606)>C(0.614)；由地径回归方程的系数及其p值可知，B因素(p=0.801)和C因素(p=0.168)均不能引入地径回归方程，由标准偏回归系数可知因素的主次顺序为A(4.829)>C(1.476)>B(0.258)；由主根长回归方程的系数及其p值可知，C因素(p=0.831)不能引入主根长回归方程，由标准偏回归系数可知因素的主次顺序为B(2.932)>A(2.099)>C(0.444)；由鲜重回归方程的系数及其p值可知，B因素(p=0.778)和C因素(p=0.222)均不能引入鲜重回归方程，由标准偏回归系数可知因素的主次顺序为A(3.785)>C(1.295)>B(0.288)。

表4 试验因素对蓝桉种子萌发和幼苗生长影响的回归方程及其拟合度和方差分析Table 4 Regressione quation, fitting degree and variance analysis of the regressione quation of effects of experimental factors on seeds germination and seedlings growth of E. globulus

表5 试验因素对蓝桉种子萌发和幼苗生长影响的回归方程的系数及其检验结果Table 5 Coefficient and tested result of the regression equation of effects of experimental factors on seeds germination and seedlings growth of E. globulus

因素A、B对发芽率、苗高、主根长的影响均有显著性，且因素A和因素B的系数均为正，表明发芽率、苗高、主根长均随因素A、B的增加而增加，因此因素A、B的取值皆应偏上限，即琼脂8.8 g/L和NAA 0.8 mg/L，将上述各值分别带入发芽率、苗高、主根长回归方程，得y发芽率=72.20、y苗高=15.963、y主根长=8.468，这些计算结果均分别好于5种试验处理组合所得到的最高发芽率(66.42)、最大苗高(14.333)、最大主根长(6.954)，故从种子萌发、幼苗苗高和主根长生长来说，理论最优处理组合为A5B5(琼脂8.8 g/L，NAA 0.8 mg/L)。

因素A对地径、鲜重的影响均有显著性，且因素A的系数为正，表明地径、鲜重均随因素A的增加而增加，因此因素A的取值应偏上限，即琼脂8.8 g/L，将上述值分别带入地径、鲜重回归方程，得y地径=8.691、y鲜重=2.278。地径计算结果次于5种试验处理组合所得到的最大地径(9.820)，故从地径来说，虽可得其理论最优处理为A5(琼脂8.8 g/L)，但该理论最优处理的促生效应不如试验最优处理组合(A4B3C1)。鲜重计算结果好于5种试验处理组合所得到的最大鲜重(2.101)，故从鲜重来说，理论最优处理为A5(琼脂8.8 g/L)。

因素C对发芽率、苗高、主根长、地径、鲜重的影响均无显著性，故针对这5个测定指标，因素C可任取，为简化试验操作，降低试验成本，因素C取0 mg/L。因素B对地径、鲜重的影响均无显著性，故针对这2个测定指标，因素B可任取；因素B对发芽率、苗高、主根长的影响均有显著性，且因素B取NAA 0.8 mg/L；综合因素B对5个测定指标的影响和取值，认为因素B取NAA 0.8 mg/L是适宜的。综上所述，利于蓝桉种子萌发和幼苗生长的理论最优处理组合为A5B5C1(琼脂8.8 g/L，NAA 0.8 mg/L，6-BA 0 mg/L)。

3 结论与讨论

本研究以不同琼脂用量的MS培养基为基础培养基，并在其中添加不同浓度的6-BA和NAA，对蓝桉种子进行无菌培养，描述统计分析认为，较高浓度的琼脂用量(6.8～8.8 g/L)、一定浓度的NAA(0、0.4、0.8 mg/L)及6-BA(0、0.2、0.8 mg/L)配合使用，可促进蓝桉种子萌发和幼苗生长。

方差分析和多重比较发现，既利于蓝桉种子萌发又利于幼苗生长的试验最优处理组合为A4B3C1(琼脂7.8 g/L，NAA 0.4 mg/L，6-BA 0 mg/L)，本研究结果与前人就其他植物种子无菌培养激素调控的研究结果有所不同，例如令狐昱慰等[17]对山白树种子无菌培养认为，GA3、6-BA和IBA均可提高山白树种子的发芽率和幼苗的生长速率，一定浓度的6-BA在促进种子萌发的同时，还可促进胚根的伸长和侧根数量的增多；Zhai等[18]认为，0.05 g/L和0.075 g/L的NAA可分别显著促进梧桐幼苗主根和主茎的生长，可见针对不同的植物种，其种子无菌培养激素调控的适宜激素种类和浓度需进行具体的筛选。

通过回归分析，发芽率、苗高、地径、主根长和鲜重等5个测定指标均求得其相应的、可信的回归方程，对回归方程中因素的显著性、主次顺序、系数及其检验分析认为，琼脂用量和NAA浓度的取值偏上限(琼脂8.8 g/L，NAA 0.8 mg/L)、6-BA浓度任取时，可更好地促进蓝桉种子萌发和幼苗生长，由此得到理论最优处理组合为A5B5C1(琼脂8.8 g/L，NAA 0.8 mg/L，6-BA 0.0 mg/L)。

本研究的试验最优处理组合和理论最优处理组合不一致，综合考虑处理措施对蓝桉种子萌发和幼苗生长的促进效果以及处理措施的经济节约性，推荐试验最优处理组合A4B3C1(琼脂7.8 g/L，NAA 0.4 mg/L，6-BA0.0 mg/L)为蓝桉实生瓶苗培育的琼脂用量和外源激素用量。本研究构建了蓝桉实生瓶苗培育技术体系，并获得健壮无菌的实生瓶苗，可为蓝桉组培技术体系的构建提供充足且理想的外植体材料来源。