几种中药内生细菌对梨黑斑病菌的抑制作用研究

侯晓杰 梁魁景 于占晶

（衡水学院生命科学学院 河北 衡水 053000）

梨黑斑病(A.kikuchiana)的发生给广大梨农造成了严重的经济损失。梨黑斑病具有发病部位广、危害时间长等特点，主要危害梨的叶、芽和果实。2004年，美国和加拿大对有梨黑斑病的品种进行筛选和舍取，在当时很大程度上影响了我国果树经济的发展趋势。

目前，对梨黑斑病的防治主要从化学疗法方面进行干预。然而，化学杀菌剂对人类的健康会造成很大影响，并且长期依赖单一杀菌剂可能导致病原菌变异。因此，急需寻找一种更安全的防治梨黑斑病的技术，代替或者辅助化学农药防治。

生物防治具有成本低、无污染、不破坏土壤结构、能保持农业生态平衡、有害微生物不易产生抗性、易于产业化等一系列优点，因此被认为是最高效的生物控制措施，近年来在农业生产中得到越来越广泛的应用，可作为植物病害防治的新的发展途径。目前，植物内生细菌的生物防范研究和实践在全世界生物研究领域中具有不可忽视的重要作用。李长根等采用分离自银杏组织的内生细菌的发酵液提取物来抑制林木变色真菌。宋美仙从银杏组织中分离筛选出对萝卜软腐病菌有较强抑制作用的内生细菌。研究人员对从西梅(PrunusdomesticaL.)果实表面分离到的拮抗细菌XM2进行鉴定，进一步证实细菌XM2对梨黑斑病菌的产生能够起到抑制作用。本试验的目的是筛选优质梨黑斑病拮抗菌。

1 材料与方法

1.1 试验材料。梨黑斑病菌、20种中药内生细菌，均由衡水学院园林植物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 梨黑斑病菌菌丝生长的室内抑菌效果初筛。采用平板对峙法。超净工作台上对梨黑斑菌边缘打取菌饼，用接种铲将其接种到PDA平板中心。用无菌接种环将中药内生菌接种在病原菌上下2.5cm处，画一直线，每株菌设3个重复，同时设置对照。倒置于28℃培养箱内暗培养，48h后观察并测量菌落生长情况，之后每隔24h测量1次，直到对照满为止，计算抑制率。选择对梨黑斑病有较好抑制作用的内生细菌继续进行试验。

1.2.2 梨黑斑病菌菌丝生长的室内抑菌效果复筛。采用滤纸片法。同上将梨黑斑病菌菌饼接种在PDA平板中央，在距离病原菌周围3cm处放置3个无菌滤纸片，使之形成等边三角形，在滤纸上滴入20μlOD值为0.600的细菌菌悬液，在28℃恒温培养箱中倒置培养，待48h后观察并测量菌落生长情况，之后每隔24h测量1次，直至对照长满，并计算抑菌率。抑菌率计算公式：菌丝生长抑制率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100%。

1.2.3 数据统计分析。使用MicrsoftExcel2019绘制和分析数据，并使用SPSS22.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 梨黑斑病菌拮抗中药内生菌的筛选。由表1可知，在20种内生菌中，益母草叶6、益母草叶2、益母草叶4、益母草叶1、知母根6和益母草叶8等6种内生菌对梨黑斑病菌有较显著抑制作用，抑制率分别达到92.55%、90.98%、88.63%、83.92%、80.78%和80.00%。这6种细菌之间差异不显著，选取进行下一步试验；而益母草根2、益母草根4、知母根5、知母叶2、知母根3、知母叶1、知母根4这7种细菌抑菌效果不明显，抑菌率低于30%，分别为2.74%、7.84%、7.84%、9.41%、14.15%、17.25%、26.27%，这7种细菌的抑菌效果较差，舍去；其余7种细菌抑菌效果一般，抑菌率在30%～80%，与内生菌益母草叶4、益母草叶1、知母根6、益母草叶6、益母草叶2、益母草叶8差异显著，舍去。

表1 中药内生细菌对梨黑斑病菌菌丝生长抑制效果

2.2 中药内生细菌对梨黑斑病菌菌丝生长的拮抗性能比较。根据初筛结果，对选用的6种对病菌抑制效果较好的内生菌，用滤纸片法进行复筛，结果如表2所示。由表2可知，这6种中药内生细菌对梨黑斑病菌都具有抑制作用，其中益母草叶4抑制效果最好，平均抑菌率达到60.39%，益母草叶1、知母根6和益母草叶6抑菌效果次之，平均抑菌率分别为50.72%、49.15%和47.96%，而益母草叶2和益母草叶8抑制效果一般，平均抑菌率分别为42.75%、40.39%。益母草叶4与其他几种内生细菌之间差异显著。益母草叶1、知母根6和益母草叶6三者之间无显著差异，但三者与益母草叶8和益母草叶2差异显著。益母草叶8和益母草叶2两者无显著差异。

表2 初筛得到的内生细菌对梨黑斑病菌菌丝生长抑制效果

3 结论与讨论

本次试验是对从药用植物益母草和知母的根、茎、叶中分离提取出的20种内生细菌进行研究，大部分内生细菌对梨黑斑病菌有着较好的抑菌效果，这之中益母草叶4对抗菌群产生的防御最强，抑菌率达60.39%，能够达到比其他内生细菌更加稳定和强烈的效果，而益母草叶1、知母根6、益母草叶6对病原菌抑制效果较好，抑菌率分别是50.72%、49.15%、47.96%，对拮抗性菌株需要一步研究其作用机理及发酵条件等。

内生细菌在防治植物病害和促进植物健康生长方面具有非常巨大的应用潜力。内生细菌进一步构成植物内部自然的防御体系，在植物生长中，起到全面化、多元性的预防和促进的作用。内生细菌在药用植物益母草、黄芪、防风和知母等的根、茎、叶中广泛存在，种类多样。目前，学术界对农作物、果树以及蔬菜方面的病害生防菌的筛选研究为本试验提供了大量理论依据。本试验研究表明，益母草叶4的抑制作用能够在梨黑斑病菌中发挥效用，这为进一步研究中药内生菌防治梨黑斑病奠定了基础。随着生物防治技术的提高，再配合合理的化学防治，将会更好的促进农林业健康发展，更好地维护环境的可持续发展。