肝硬化患者口腔和肠道菌群的变化及其相关性

任海霞 闫华楠 牛淑利 郭永泽 李博 张宏伟 安凯

临床上很多肝硬化患者会出现腹痛、腹泻等胃肠道疾病，考虑与肠道菌群紊乱有关。近年来“肠-肝轴”已经成为人们关注的热点，且证明肠道菌群紊乱会影响肝硬化的进展[1]。研究表明，不良的口腔微环境与肝脏之间可能存在联系，但目前关于“口腔-肠-肝轴”的研究较少。本研究通过16S rRNA基因测序初步探讨肝硬化患者口腔及肠道菌群的变化，旨在调节口腔及肠道菌群来减缓肝硬化的进展。

资料与方法

一、研究对象

选取河北工程大学附属医院及邯郸市传染病医院2020年6月至2020年11月临床诊断为肝硬化的患者19例作为肝硬化组，选择同期健康体检者19名作为健康组，采集以上人群的粪便及唾液标本。本课题已通过河北工程大学附属医院医学伦理委员会审批，受试者均自愿参与并签署了知情同意书。

二、入选标准

健康组：年龄、性别、体重指数(body mass index ，BMI)与肝硬化组相匹配，无消化系统疾病、自身免疫系统疾病、感染性疾病、神经系统疾病、器官功能障碍等，实验室指标均正常。

肝硬化组：影像学检查并结合临床诊断为肝硬化，诊断符合《肝硬化诊治指南》[2]，可合并腹水、肝性脑病、肝癌、食管/胃底静脉曲张(OB转阴)等并发症。

三、排除标准

①有其他器官功能障碍；②合并糖尿病、高血压、癌症、乳糜泻、炎症性肠病和代谢综合征；③4周内接受抗生素、益生菌治疗；④有牙科病史和口腔检查发现有活动性牙龈或牙周病；⑤孕妇或哺乳期妇女。

四、标本采集

唾液采集：晨起床后不刷牙，用清水将口腔内的掺杂物洗漱干净，手持无菌、无酶收集管，保持唾液在口中持续至少1 min，收集2～5 mL。-86℃冻存。

粪便采集：早晨空腹前用粪便取样器截取样品中段里部，取50～100 mg，每个样品取2管备份，-86 ℃冻存。

五、DNA提取及16SRNA 基因测序

粪便及唾液样本均采用Qubit®dsDNA BR Assay 试剂盒 (美国Invitrogen)提取，用1%琼脂糖凝胶检测DNA质量。取30 ng DNA样品及融合引物配置PCR反应体系。针对16SRNA V3-V4可变区域进行PCR扩增。使用引物(341F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG/806R GACTACHVGGGTWTCTAAT)。使用 Agencourt AMPure XP 磁珠进行纯化并溶于 Elution Buffer，贴上标签，至此文库构建完成，文库检测使用Agilent 2100 Bioanalyzer 检测文库的片段范围及浓度，将检测合格的文库，采用lllumina Hiseq2500进行测序，测序类型为PE300。

六、生物信息学分析

下机数据过滤，剩余高质量的Clean data用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成Tags；将Tags聚类成OTU并与Greengene数据库比对、 物种注释；基于OTU和注释结果进行样品物种复杂度分析，组间物种差异分析，以及关联分析与模型预测等。

七、统计学方法

结 果

一、一般资料

肝硬化组男13例，女6例，年龄为(49.7±11.0)岁，BMI为(24.01±2.26)kg/m2；健康对照组男9例，女10例，年龄为(49.2±9.4)岁，BMI为(23.18±1.56)kg/m2；两组年龄、BMI比较差异无统计学意义(t=-0.144、1.314，均P>0.05)。

二、两组OTU聚类Venn图

将研究对象的粪便样本及唾液样本经Illumina测序，根据有效数据97%的类似进行OTU聚类，并绘制Venn图(图1)。健康组肠道共有OTU 526个，口腔共有OTU 436个；肝硬化组肠道共有OTU 642个，口腔共有OTU 534个。4组样本共有72个OTU相互重叠，其中健康组口腔及肠道共有82个OTU相互重叠，肝硬化组口腔及肠道共有160个OTU相互重叠。表明口腔与肠道物种虽然存在一定差异，但也存在相同的物种，且肝硬化组与健康组相比口腔与肠道重叠物种更多。

注：HCFe为健康组粪便；HCSa为健康组唾液；HSFe为肝硬化组粪便；HSSa为肝硬化组唾液

三、Alpha多样性分析

一般从Shannon、Chao1、Simpson、ACE等来评估物种的多样性及丰富度，Shannon指数和Simpson指数可以反映物种的多样性，Chao1指数和ACE指数可以反映物种的丰富度。与健康组相比，肝硬化组肠道菌群多样性及丰富度均出现下降，口腔菌群的多样性及丰富度也均出现下降，见表1。绘制稀释曲线，随着测序深度的增加曲线会逐渐上升，当测序达到一定深度则曲线不再上升，说明多样性已经达到饱和，如图2所示稀释曲线趋于平坦，说明此样本量下能够很好地反映肠道及口腔物种的多样性。

表1 健康组与肝硬化组口腔及肠道菌群的丰富度与多样性比较

图2 口腔及肠道样本的稀释曲线

四、Beta多样性分析

Beta多样性，不仅可以反映样本之间的多样性距离关系，而且还可以反映生物群落之间的分化程度，通过PCOA(principal coordinate analysis)分析口腔及肠道菌群之间的差异性，PC1的贡献率为51.78%，PC2的贡献率为6.96%。结果所示肠道和口腔样本之间明显分离，说明无论是否合并肝硬化口腔和肠道菌群均明显不同，且粪便样本间的距离要明显大于唾液样本间的距离，说明肠道菌群个体间的差异性要大于口腔菌群个体间的差异性。见图3。

图3 口腔及肠道菌群的Unweighted-Unifrac PCOA图

五、两组间口腔和肠道菌群分类学组成分析

通过与数据库进行比对，对OTU进行物种分类，并分别在门和属水平对各样品作物种丰度柱状图。结果如图4所示，在门水平上肠道及口腔中的主要物种均是由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门，在属水平上，尽管口腔和肠道菌群组成差异明显，但有部分菌属是口腔及肠道共有的。肠道菌群在门水平上，肝硬化组变形菌门丰度显著高于健康组(P<0.05)，而拟杆菌门丰度低于健康组(P>0.05)；在属水平上，肝硬化组毛螺菌属丰度显著低于健康组，而大肠杆菌属、韦荣球菌属丰度显著高于健康组(均P<0.05)。口腔菌群在门水平上，肝硬化组厚壁菌门丰度显著高于健康组，而变形菌门丰度显著低于健康组(均P<0.05)；在属水平上，韦荣球菌属、纤毛菌属丰度显著高于健康组，而嗜血杆菌属丰度显著低于健康组(均P<0.05)。

注：左图为门水平，右图为属水平

讨 论

口腔和肠道都是人体消化系统最重要的组成部分，目前已经发现食道癌、结肠炎症及肿瘤、胰腺癌等疾病均有口腔和肠道菌群的参与[3-5]。文献报道，慢性肝病患者肠道菌群会出现明显的改变，肝硬化出现并发症如腹水、HE和静脉曲张破裂出血患者更容易出现牙周炎[6,7]，因此猜测口腔和肠道菌群对肝硬化患者的发生发展有重要作用。

本研究中Venn图示口腔和肠道存在特有的OTU，也有部分OTU存在相互重叠，而肝硬化患者与健康组相比口腔和肠道菌群相互重叠的OTU更多，说明口腔和肠道菌群有相同的物种存在，且肝硬化患者口腔和肠道菌群存在更多的相同物种。进一步从物种组成丰度柱状图上分析发现在门水平上肠道和口腔中的物种均是由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门组成，而在属水平上口腔和肠道菌群虽然组成成分上有很大区别，但有共同菌属存在；PCOA结果显示无论是否合并肝硬化口腔和肠道菌群均明显不同，且肠道菌群个体间的差异性要大于口腔菌群个体间的差异性；Alpha多样性指数分析结果表明肝硬化患者口腔和肠道菌群多样性及丰富度均出现下降，说明肝硬化患者口腔和肠道菌群出现了明显的失衡，上述研究结果与文献报道一致[8-10]。

通过口腔和肠道菌群分类学组成分析结果发现门水平上，在肠道菌群中肝硬化患者变形菌门显著增加，在口腔菌群中，肝硬化患者厚壁菌门丰度显著增加，而变形菌门丰度显著降低，因此变形菌门可能是肝硬化患者一种潜在的生物标志物。变形菌门在口腔及肠道中均占有优势，研究表明肥胖、糖尿病、UC、IBD等疾病均会出现变形菌门失衡[11-13]。在属水平上发现口腔和肠道菌群中韦荣球菌均增加，韦荣球菌在肝硬化患者的口腔及肠道紊乱中可能有重要作用，韦荣球菌在口腔菌群中富集，正常情况下可以促进口腔黏膜屏障的形成[14]，但在异常情况下就会成为条件致病菌引起口腔疾病并且破坏口腔黏膜屏障进入到肠道。因此考虑肝硬化患者韦荣球菌的增加可能是口腔菌群侵入到肠道所致。

综上所述，肝硬化患者口腔和肠道菌群出现明显失衡，口腔条件致病菌增加且破坏口腔黏膜防御系统，引起口腔细菌向肠道移位。有研究证实口腔内细菌可以促进肠道炎症性疾病的发生，引起肠道菌群失衡[15-16]。因此肝硬化的患者可以通过保持口腔清洁来减少条件致病菌增加，且可以口服益生菌来改善肠道菌群的紊乱，从而预防肝硬化的进展[17]。

本研究在样本选择过程中没有详细调查患者的饮食情况，且样本量较少，今后需要扩大样本量进一步研究。本研究初步探讨了肝硬化患者口腔和肠道菌群的改变，对于肝硬化患者差异菌群的具体作用以及口腔和肠道菌群之间细菌移位机制仍需要进一步研究。