血清ANRIL和miR-122在隐匿性乙型肝炎病毒感染中的表达关系研究

李想 王妍柏 王银锋 黄学兰

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的疾病，具有传染性、流行性等特征[1]。血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性是HBV感染的重要依据，但部分患者血清HBsAg检测为阴性，但肝脏组织或血清中HBV DNA检测为阳性，此部分患者称为隐匿性HBV感染患者[2]。隐匿性乙型肝炎目前仍缺乏早期诊断标志物，严重威胁人类生命健康。研究表明，微小RNA-122(microRNA-122，miR-122)在乙型肝炎的发生发展及HBV复制过程中呈异常表达[3]。细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 Locus，ANRIL)属于长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNA)的一种，是多种疾病的易感位点，研究表明，miR-122是ANRIL的靶基因之一[4]。因此，本研究对隐匿性乙型肝炎等患者血清ANRIL、miR-122进行检测，结合临床指标分析探讨ANRIL、miR-122对隐匿性乙型肝炎的鉴别诊断价值，以期为临床上开发早期隐匿性乙型肝炎诊断指标提供新思路。

资料与方法

一、一般资料

选取2019年2月至2021年1月宁夏医科大学总医院感染科收治的20例隐匿性乙型肝炎患者为隐匿性乙型肝炎组，平均年龄(46.95±10.02)岁；选取同期住院治疗的80例慢性乙型肝炎患者作为慢性乙型肝炎组，平均年龄(47.22±10.13)岁；另同期选取80例健康体检者作为健康对照组，平均年龄(46.83±9.48)岁。

纳入标准：①慢性乙型肝炎诊断符合相应指南[5]，隐匿性乙型肝炎诊断符合诊断标准[6]；②年龄≥20岁，病例资料齐全者；③一个月内未使用免疫抑制剂、抗炎药物者；④试验符合伦理学标准，患者均自愿参加。排除标准：①有结核病、酒精性肝病、遗传代谢性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病者；②有免疫缺陷病毒或其他病毒感染者；③有肝硬化迹象者。

查阅门诊及住院病历，收集整理患者年龄、性别、体质指数(body mass index，BMI)等一般资料。

二、主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒(货号：JL1545)购自德国QIAGEN公司；反转录试剂盒(货号：YT9036)购自北京伊塔生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(货号：RR820A)购自日本Takara公司；HBV核酸定量检测试剂盒(货号：QMTEZ-7147)购自上海圻明生物科技有限公司。qRT-PCR仪(型号：Stratagene Mx3005P)购自上海普迪生物科技有限公司；酶标仪(型号：Infinite F50)购自奥地利Tecan公司；全自动生化分析仪(型号：YSI 2950)购自瑞士INFORS公司。

三、研究方法

(一)样品采集及保存 采集健康体检者体检当天及慢性乙型肝炎和隐匿性乙型肝炎患者入院第二天清晨空腹静脉血，离心后收集血清，-80℃保存。

(二)血清ANRIL、miR-122水平测定 采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测受试者血清ANRIL、miR-122表达水平。采用试剂盒提取血清总RNA并反转录得cDNA。采用qRT-PCR仪扩增ANRIL、miR-122及其内参基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，序列见表1。反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，45个循环。每个样品重复3次，采用2-△△CT法计算血清ANRIL、miR-122相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

(三)血清TBil、ALT、AST水平检测 采用全自动生化分析仪检测血清总胆红素(total bilirubin，TBil)、丙氨酸氨基转移酶(alanine transarninase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平，操作步骤严格按照仪器使用说明书进行。

(四)HBV DNA载量检测 采用PCR结合荧光探针的体外DNA扩增技术检测血清HBV DNA载量。HBV引物序列及荧光探针序列见表2，引物及探针由中山医科大学达安基因诊断中心合成。DNA提取后，依照HBV核酸定量检测试剂盒(PCR结合荧光探针的体外DNA扩增技术)说明书进行操作，之后放入qRT-PCR仪进行扩增。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火1 min，40个循环。反应结束后电脑分析计算HBV DNA拷贝数。

表2 HBV引物及荧光探针序列

四、统计学分析

结 果

一、健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型肝炎组一般资料比较

健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型肝炎组年龄、性别、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；慢性乙型肝炎组TBil、ALT、AST水平高于隐匿性乙型肝炎组和健康对照组，HBV DNA载量高于隐匿性乙型肝炎组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型肝炎组一般资料比较[n，(±s)]

二、健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型肝炎组血清ANRIL、miR-122比较

慢性乙型肝炎组血清ANRIL高于隐匿性乙型肝炎组和健康对照组，miR-122低于隐匿性乙型肝炎组和健康对照组；隐匿性乙型肝炎组血清ANRIL高于健康对照组，miR-122低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型肝炎组血清ANRIL、miR-122比较(±s)

三、隐匿性乙型肝炎患者血清ANRIL、miR-122与TBil、ALT、AST、HBV DNA载量的相关性

Pearson法分析结果显示，隐匿性乙型肝炎患者血清ANRIL与miR-122呈负相关(r=-0.597，P<0.05)，且ANRIL与TBil、ALT、AST、HBV DNA载量均呈正相关(P<0.05)；miR-122与TBil、ALT、AST、HBV DNA载量均呈负相关(P<0.05)。见图1、表5。

图1 隐匿性乙型肝炎患者血清ANRIL与miR-122的相关性

表5 隐匿性乙型肝炎患者血清ANRIL、miR-122与TBil、ALT、AST、HBV DNA载量的相关性

四、血清ANRIL、miR-122鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的价值

以血清ANRIL、miR-122水平为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，血清ANRIL、miR-122鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的曲线下面积(area under curve，AUC)分别为0.901(95%CI: 0.796～0.996)、0.887(95%CI: 0.822～0.953)，截断值分别为1.218、0.847，特异度分别为91.2%、73.8%，敏感度分别为85.0%、95.0%；二者联合鉴别诊断的AUC为0.941(95%CI: 0.868～0.998)，特异度为96.3%，敏感度为90.0%。见图2。

图2 血清ANRIL、miR-122鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的ROC曲线

五、影响隐匿性乙型肝炎发生的多因素Logistic回归分析

将是否发生隐匿性乙型肝炎作为因变量，以ANRIL、miR-122、TBil、ALT、AST、HBV DNA载量为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示ANRIL是影响隐匿性乙型肝炎发生的独立危险因素(P<0.05)，miR-122是影响隐匿性乙型肝炎发生的保护因素(P<0.05)。见表6。

表6 影响隐匿性乙型肝炎发生的多因素Logistic回归分析

讨 论

关于引起隐匿性乙型肝炎的原因，目前尚无统一观点，但仍可确认隐匿性乙型肝炎是病毒(如突变或病毒DNA整合到宿主基因组中)和宿主(如长期的HBV特异性T细胞的免疫反应或免疫系统紊乱)共同作用的结果[7]。目前在隐匿性乙型肝炎个体中，即使是检测“金标准”——检测HBV DNA载量的方法也存在一定局限性，因其血清HBV DNA含量通常较低，有时甚至无法用当前的技术手段检测到，因此可能出现假阴性的结果[8]。隐匿性乙型肝炎患者体内病毒仍处于低复制状态，会加速患者肝脏疾病进展，威胁器官移植、输血等的安全性[9]。

lncRNA是由基因组中非编码序列转录生成的，其长度大于200 nt且不具有翻译成蛋白质能力，许多lncRNA在表观遗传、翻译及蛋白修饰过程中均可发挥重要的调控作用[10]。ANRIL作为一种lncRNA，其在包括肝癌在内的多种肿瘤中发挥重要的致癌基因作用[11]。Ma等[12]研究证实，ANRIL可调节肝癌细胞增殖和细胞周期发展。miR-122在肝脏发育、脂质代谢、肝癌细胞的发生发展等过程中均发挥重要调控作用，可作为肝脏特异性表达指标[13]。荆晓晴等[14]研究显示，HBV携带者外周血单核细胞中miR-122表达异常，且可能与病毒增殖有关。本研究结果显示，隐匿性乙型肝炎患者及慢性乙型肝炎患者血清中ANRIL表达水平升高，miR-122表达水平降低，且隐匿性乙型肝炎患者中二者与HBV DNA载量均呈一定的相关性，miR-122表达趋势与徐兰锋等[15]及马青松等[16]研究结果一致，提示ANRIL的高表达、miR-122的低表达可能与肝炎的发生发展有关。Ma等[17]研究表明，ANRIL可通过调节miR-122的表达调节肝癌细胞的增殖、转移和侵袭。本研究推测ANRIL可能通过靶向调节miR-122转录，使其表达水平降低，进而影响HBV复制活动，调控乙肝病情的发生发展。进一步采用多因素Logistic回归分析，结果显示ANRIL、miR-122均是影响隐匿性乙型肝炎发生的因素。进一步验证了ANRIL、miR-122在隐匿性HBV复制及病情进展中的作用。本研究采用ROC曲线分析了ANRIL、miR-122在隐匿性乙型肝炎中的鉴别诊断效能，结果表明ANRIL、miR-122鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的最佳截断值分别为1.218、0.847，两指标均有较高的诊断效能，且二者联合后的诊断特异度为96.3%，均高于二者单独检测(分别为91.2%、73.8%)。此外，本研究中血清ANRIL、miR-122与肝功能指标TBil、ALT、AST均有相关性，这提示ANRIL、miR-122可能通过影响HBV复制，加速隐匿性乙型肝炎患者病情进展，造成其肝功能损伤。

综上所述，隐匿性乙型肝炎患者血清ANRIL表达水平升高，miR-122表达水平降低，二者均与HBV DNA载量有关，且在鉴别诊断隐匿性乙型肝炎中有较高的诊断效能。ANRIL、miR-122可能通过影响HBV复制参与隐匿性乙型肝炎的发生、发展。ANRIL、miR-122可能有较高的应用价值，值得临床医师关注，但因本研究收集病例数有限，结果可能存在一定的局限性，且具体机制尚需进一步通过动物模型实验证实。