H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

杨时鳗，许程志，许榜丰，吴运谱，贾云慧，乔传玲 ，陈化兰

H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

1中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150069；2辽宁中医药大学实验动物中心，沈阳 110847

【】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对，确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物，构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID50）。将拯救的亲本病毒、HA单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞，测定病毒的体外复制能力；将上述各株病毒以50 μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠，分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器，匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况；将病毒分别以50 μL含101-106EID50的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠，感染后每天称量小鼠体重，当小鼠体重下降比率超过25% 时判定为死亡，统计死亡情况，测定病毒的小鼠半数致死量（MLD50），评估各突变病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒进行分析比较后，获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4个氨基酸差异位点，分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认，分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况，结果发现与亲本病毒rZD71相比较，突变病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后，复制滴度均显著提高；与rSY130相比较，突变病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后，复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现HA 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒rZD71相比，225位氨基酸由G突变为E后，病毒rZD71-HA/G225E的MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0 log10EID50；病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到，而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。HA蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用，提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况，为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。

猪流感病毒；HA蛋白；氨基酸；致病性

0 引言

【研究意义】HA和NA蛋白是A型流感病毒的两种重要糖蛋白，根据其抗原性和遗传特性的不同而分为不同的亚型。现已有16种HA亚型和9种NA亚型的病毒以任何一种可能的组合方式的病毒在禽类体内分离到[1-2]。在猪群中主要流行H1N1、H1N2和H3N2 3种亚型的猪流感病毒（swine influenza virus, SIV）[3]，其中H1N1亚型病毒又划分为经典型、类禽型、类人型和2009/H1N1[4]。近些年的流行病学研究结果表明，欧亚类禽型H1N1（eurasian avian-like, EA H1N1）亚型流感病毒在我国猪群中的流行极为广泛[5-6]；也有在犬、水貂中分离到EA H1N1病毒的报道[7-8]；更为重要的是，该类病毒导致了人的零星感染与发病，更加凸显了EA H1N1病毒潜在的公共卫生威胁[9-10]。【前人研究进展】流感病毒血凝素（hemagglutinin, HA）蛋白的主要功能是与细胞膜表面的受体结合，介导病毒与细胞内体膜的融合，致使病毒核糖核蛋白释放进入细胞浆中。在融合之前，HA会被裂解成为两个以二硫键相连的亚单位（HA1和HA2）[11]。由于流感病毒囊膜与细胞膜的融合需要HA2氨基末端的介导，因此，HA的可裂解性是流感病毒感染的重要决定因素[12]。HA受体结合位点也影响着病毒毒力，能与α-2,3-唾液酸受体（α-2,3-SA）或α-2,6-唾液酸受体（α-2,6-SA）结合，进而决定着病毒的宿主范围和组织嗜性[13]。已有研究报道HA蛋白138位氨基酸和225位氨基酸分别位于HA受体结合位点的130Loop 和220Loop 中，对流感病毒，尤其是H1、H2和H3亚型病毒的受体结合特性有重要影响[14-15]。当病毒发生A138S 突变时，可以提高禽流感病毒对哺乳动物的适应性和致病能力[16]；当发生G225E 或G225D 突变时，可以提高H1亚型禽流感病毒结合人源α-2,6 SA 受体的能力[17]。另有研究表明，当1918年大流行毒株A/South Carolina/1/18（H1N1）在发生HA D225G 突变后，病毒在雪貂间的飞沫传播能力明显下降[18]。兽医生物技术国家重点实验室之前通过比较分析两株EA H1N1 SIV在豚鼠中的传播能力，发现病毒HA蛋白225位氨基酸（E或者是G）是决定病毒传播能力差异的关键氨基酸[19]。近期开展的两株H1N1 SIV模式病毒（ZD71和SY130）对小鼠致病性的研究中发现，在单HA基因片段替换后，拯救病毒的致病力与亲本病毒相比，出现了反向增强的现象，即原本致病力强的病毒变得更强[20]。【本研究切入点】为了进一步探索究竟是哪些基因影响了病毒对小鼠的致病性，首先需要对两株模式病毒的HA基因序列进行比对，找到其差异氨基酸；进而分别以ZD71和SY130两个模式病毒为背景，利用定点突变和反向遗传学技术，救获一系列HA蛋白单点突变病毒；测定病毒的体外复制能力及其对小鼠的致病性，分析突变位点对病毒致病性的影响。【拟解决的关键问题】通过比较分析病毒的体内外复制能力及对小鼠的致病性，确定影响H1N1 SIV对小鼠致病性的关键氨基酸位点，以期进一步了解流感病毒致病力差异的分子基础。

1 材料与方法

试验于2019年1月至12月在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室完成。

1.1 质粒、细胞和实验动物

双向表达质粒pHW2000由美国St.Jude儿童医院RICHARD WEBBY教授馈赠，MDCK细胞、A549细胞、293T细胞均由动物流感实验室保存，9—11日龄SPF鸡胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心，9—11日龄非免疫鸡胚由哈尔滨维科生物技术有限公司提供。6周龄SPF级BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。两株H1N1亚型SIV A/swine/Liaoning/ZD71/2015（简称ZD71）和A/swine/Liaoning/ SY130/2015（简称SY130）的反向遗传系统（rZD71和rSY130）、含有SY130病毒HA基因的单基因替换重组病毒（rZD71-HA）及含有ZD71病毒HA基因的单基因替换重组病毒（rSY130-HA）均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室构建并保存[20]。

1.2 试剂和试剂盒

病毒RNA 提取试剂盒（TIANamp Virus RNA Kit）购自天根生物有限公司；M-MLV反转录试剂盒购自Invitrogen公司；2×PrimeSTAR MAX Premix DNA 聚合酶购自大连宝生物有限公司；限制性内切酶BI以及I 购自NEB公司；同源重组试剂盒ClonExpress®II One Step Cloning Kit 以及质粒小提试剂盒购自南京诺唯赞生物公司；胶回收试剂盒和PCR 产物纯化试剂盒购自OMEGA公司；质粒中提试剂盒购自QAIGEN公司；DNA测序试剂购自Applied Biosystems 公司；脂质体LipofectamineTM3000购自Invitrogen公司；培养基OPTI-MEM、DMEM和F-12K购自Gibco公司。

1.3 含有单点突变重组病毒的拯救

对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对分析，针对差异位点设计点突变引物，以质粒pHW-HA为模板，通过PCR构建含有HA基因单点突变的质粒，进行测序鉴定，中量法提取阳性质粒。将突变质粒与其相应的其他7个质粒，各取250ng与250 μL Opti-MEM混匀；另取10 μL脂质体与250 μL Opti-MEM混匀，孵育5 min；脂质体与质粒再次混匀、静置30 min，转染293T细胞。37℃培养12 h后，弃去转染液，加入2 mL含0.2μg·mL TPCK-胰酶的Opti-MEM，继续培养48 h，取细胞培养物经尿囊腔接种于SPF鸡胚，200 μL/胚，于37℃培养72 h，测定尿囊液的HA活性（HA效价≥1﹕16判为阳性），收集HA阳性样品，再次接种SPF鸡胚增殖。对救获病毒进行全基因组序列测定，与亲本毒株基因序列进行比对，确保重组病毒的HA基因仅含有目的位点的突变，其他基因无突变。将病毒分装、保存于-80℃，用于后续试验。

1.4 鸡胚半数感染量（EID50）的测定

将待测病毒（rZD71、rSY130、rZD71-HA、rSY130-HA及其相应的点突变病毒，均为F2代）分别进行10倍倍比稀释，选取10-5—10-9稀释度的病毒液接种非免疫鸡胚，100 μL/胚，于37℃培养72 h后收取尿囊液测定其HA活性，按照Reed-Muench方法计算EID50。

1.5 病毒的体外复制特性测定

将1.4中所述各病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞，37℃孵育1h后，分别更换为含有1 μg·mL-1的TPCK-胰酶的DMEM培养基及含0.25 μg·mL-1TPCK-胰酶的F-12K培养基，并于感染后12、24、36、48、60和72 h收集感染后上清液，将所获上清液于-80℃保存备用。待所有样品收集完成后，在MDCK细胞中用终点滴定法测定病毒滴度，以平均log10TCID50/ml±标准差表示。

1.6 病毒的体内复制特性测定

为了评价每株病毒在体内的复制能力，分别将病毒以50 μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠，每个病毒感染3只，感染3 d后，将其进行安乐死，采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾，匀浆处理后接种非免疫鸡胚，测定各脏器内的病毒含量。

1.7 病毒的MLD50测定

将病毒分别以50 μL含101—106EID50的剂量经鼻腔感染5只BALB/c小鼠，感染后每天称量小鼠的体重，将体重下降比率超过25%的小鼠实施安乐死，持续观察14 d。按照Reed-Muench方法计算MLD50。

1.8 HA蛋白225位氨基酸的进化分析

从Influenza Research Database 数据库（网址www.fludb.org，截止时间为2020年12月28日）中下载分离自我国的H1N1亚型SIV HA序列1 032条，按照时间顺序对分离毒株进行划分，采用UGENE软件MAFFT算法进行比对，分析HA 225 位氨基酸的进化情况。

1.9 数据统计分析

应用GraphPad Prism 8.0软件对病毒在细胞上的复制滴度及感染小鼠后组织中的病毒滴度进行统计学分析（Two-way ANOVA法）及作图。＜0.05表示统计学差异显著，＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 病毒ZD71和SY130 HA蛋白氨基酸比对分析

经比较序列分析发现ZD7和SY130这两株病毒在HA蛋白上共有4个氨基酸差异位点，分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）（表1）。

2.2 定点突变病毒的救获及病毒EID50的测定

以ZD71和SY130病毒为骨架，拯救的单点突变病毒分别命名为rZD71-HA/V4A、rZD71-HA/A138S、rZD71-HA/T144A、rZD71-HA/G225E；rSY130-HA/A4V、rSY130-HA/S138A、rSY130-HA/A144T、rSY130-HA/ E225G。对1.1中所述各病毒及所有点突变病毒进行EID50的测定（表2）。

表1 ZD71 and SY130 病毒HA 蛋白氨基酸差异位点

表2 突变病毒的EID50测定

2.3 病毒体外复制水平的测定

利用MDCK和A549两种细胞分别测定了病毒的复制动力学，结果在MDCK细胞上，亲本病毒rZD71在感染后12—72 h的各检测时间点的病毒复制滴度范围为3.0—8.72 log10EID50/mL，而单点突变病毒rZD71-HA/G225E的病毒复制滴度范围为4.72—9.22log10EID50/mL，经比较每个时间点的病毒滴度发现突变病毒rZD71-HA/G225E的复制滴度均显著高于rZD71病毒（＜0.05至＜0.0001）（图1-A）；在A549细胞上，同样发现当HA蛋白225位氨基酸的单点突变导致病毒rZD71-HA/G225E在感染24—48 h后的复制滴度均显著高于rZD71病毒（＜0.01、0.0001）（图1-B）。同样，通过与亲本病毒rSY130相比较，发现在感染MDCK细胞12—36 h及感染A549细胞36—72 h后，单点突变病毒rSY130-HA/ E225G的复制水平均明显降低（图1-C、D）。而病毒HA蛋白4、138和144位点的氨基酸突变对相应的单点突变病毒在MDCK和A549细胞上的复制水平的影响均相对较小（图1-A—D）。

2.4 病毒体内复制能力的比较

以106EID50的病毒剂量感染BALB/c小鼠，3d后，测定小鼠各脏器的病毒含量。结果在小鼠鼻甲和肺脏中，亲本病毒rZD71的检出滴度分别为6.08和7.58log10EID50/mL，单点突变病毒rZD71-HA/G225E的检出滴度分别为6.67和7.92log10EID50/mL；而病毒rZD71-HA/G225E在小鼠的脾脏和肾脏中也均检测到，滴度分别为2.0和0.92log10EID50/mL（图2）。与亲本病毒rSY130相比，单点突变病毒rSY130-HA/ E225G在各脏器中的复制滴度均未见发生明显变化（图2）。

*：P＜0.05; **：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.0001

*：P＜0.05; **：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.0001

2.5 病毒MLD50的测定

为了进一步了解HA蛋白225位氨基酸是否为决定病毒对小鼠致病力的关键氨基酸，分别测定了rZD71、rZD71-HA、rZD71-HA/G225E、rSY130、rSY130-HA和rSY130-HA/E225G合计6株病毒的MLD50。结果rZD71病毒的MLD50为4.32 log10EID50（图3-A），而rZD71-HA和rZD71-HA/G225E病毒MLD50的测定结果均为3.0log10EID50（图3-B、C）；而rSY130、rSY130-HA和rSY130-HA/E225G病毒的MLD50均高于6.5 log10EID50（图3-D—F）。表明HA蛋白225位氨基酸的突变，导致单点突变病毒rZD71-HA/G225E对小鼠的致病力增强，MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0log10EID50。

2.6 H1N1亚型SIV HA蛋白225位氨基酸的分析

在1 032株H1N1亚型SIV国内分离株中HA蛋白225位出现过G、E、D、N、K 等5种氨基酸，呈现多样性（图4）。2000年前国内分离株中，225G的出现频率为57.0% （142/249），未发现225E。2001—2010年间，225G出现频率减少，为17.9%（81/452）；225E出现频率增加，为52.4% （237/452）。2011—2020年间，225G的出现频率持续减少，为15.4% （51/331）；225E的出现频率进一步增加，达到74.9%（248/331）。

图3 病毒MLD50的测定

*：“X”代表氨基酸D、K、N “X”denotes amino acid D, K, or N

3 讨论

流感病毒的致病性是由病毒的多个蛋白共同决定的，截至目前，已相继在PB2[21-22]、PB1[23]、PA[24]、HA[19, 25]、NP[26]及NS1[27]等多种蛋白上鉴定出一系列决定病毒致病性的关键氨基酸位点。HA蛋白作为流感病毒的囊膜糖蛋白之一，是病毒入侵宿主细胞的“钥匙”[28]。在本研究中，为了进一步探索前期研究过程中发现的一个现象，也就是为什么单单是HA基因的替换，导致了病毒致病性发生了一种不寻常的改变，究竟又是哪些位点的氨基酸决定了病毒对小鼠致病性的改变。通过序列分析，发现ZD71和SY130两株病毒在HA蛋白上共有4个位点氨基酸的差异，因此，分别以这两株病毒为骨架，拯救出8株分别含有单点突变的重组病毒。通过比较这些病毒在不同细胞上的复制能力及对小鼠的致病性，发现HA蛋白G225E的突变能够使rZD71-HA/G225E病毒体内外复制能力及其对小鼠的致病力增强，表明HA蛋白225位氨基酸是导致两株病毒对小鼠致病力差异的关键位点。

病毒的复制能力是影响流感病毒致病性及其在哺乳动物间传播的重要因素[26, 29-30]。本研究首先评价了亲本毒株、HA单基因替换病毒及单点突变病毒在MDCK和A549 细胞上的复制能力。结果表明，225 位氨基酸位点的突变可以显著影响病毒的体外复制能力，当发生G225E突变时，与亲本病毒rZD71相比，rZD71-HA/G225E的复制能力显著提高；当在rSY130背景下引入HA E225G的突变后，病毒rSY130-HA/ E225G的复制能力显著降低。这一结果表明流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒的复制能力具有重要的决定作用，是导致病毒对小鼠致病力差异的主要原因。

通过对我国H1N1亚型SIV分离毒株HA蛋白225位氨基酸序列的系统分析，发现225G和225E在近20年来分离的毒株中同时存在，且225E出现的频率逐渐增高而成为主导。WANG等[19]研究发现HA蛋白225位氨基酸的种类对EA H1N1 SIV的组装和出芽效率具有重要的决定作用，G225E的突变能够增强病毒的组装与出芽效率，提高病毒的复制能力，进而导致病毒的致病性及病毒在豚鼠之间的传播能力增强。本研究的结果进一步提示要在今后的监测中密切关注该位点氨基酸的变异情况，充分做好病毒致病性相关的风险评估。

4 结论

进一步确定了HA蛋白225位氨基酸对病毒的致病性具有重要的决定作用，当病毒获得HA蛋白G225E的突变以后，对小鼠致病性增强。提示在今后的流感病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况，为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。

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Amino Acid of 225 in the HA Protein Affects the Pathogenicities of H1N1 Subtype Swine Influenza Viruses

YANG ShiMan1, XU ChengZhi1, XU BangFeng1, WU YunPu2, JIA YunHui1, QIAO ChuanLing1, CHEN HuaLan1

1Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin 150069;2Laboratory Animal Center, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847

【】The pathogenicities of influenza viruses are determined by multiple viral genes. The results of our previous study indicated that hemagglutinin (HA) gene substitutions of the two genetically similar H1N1 swine influenza viruses altered their pathogenicities in mice. This study aimed to further identify the key amino acids affecting viral pathogenicity. 【】After analyzing the amino acid differences of HA protein between the two H1N1 viruses, the reassortant viruses bearing the single amino acid mutations were constructed using the site-directed mutagenesis primers, and their EID50values were determined. To determine the growth of the parental, reassortant and mutant viruses, MDCK cells and A549 cells were infected with the indicated viruses at a multiplicity of infection (MOI) of 0.001 and 0.1, respectively. The BALB/c mice was further intranasally (i.n.) inoculated with 106EID50of each virus, and three mice were euthanized at 3 days post-infection (dpi).The organs, including brain, nasal turbinate, lung, kidney and spleen, were collected from the mice and titrated in eggs to evaluate the viral replication abilities in vivo. The MLD50values of the indicated viruses were determined by inoculating i.n. groups of five mice with 101-106EID50of viruses. The body weight was measured daily for 14 dpi, and the mice that lost more than 25% of their original weight were euthanized for humane reasons. 【】The HA proteins of the ZD71 and SY130 viruses differed at four amino acids at positions 4, 138, 144, and 225 (H3 numbering). Four reassortants were rescued, followed by whole-genome sequencing to ensure the absence of unwanted mutations. The viral replication abilities of the reassortant viruses (rZD71-HA/G225E and rSY130-HA/E225G) were significantly affected in MDCK, as well as in A549 cells, when G225E and E225G substitutions were introduced into the rZD71 and rSY130 virus, respectively.In contrast, the mutations of the other three amino acids had little effect on viral replication. Further mouse infection experiments also demonstrated that amino acid substitutions at site 225 of HA protein significantly affected the viral pathogenicities in mice. In particular, the substitution G225E increased the pathogenicity of rZD71-HA/G225E virus, with the MLD50value of rZD71-HA/G225E virus decreasing from 4.32 log10EID50to 3.0 log10EID50, compared with that of rZD71 virus. And the virus replicated well not only in the nasal turbinate and lung, but also in the spleen and kidney. 【】A single amino acid at position 225 in the HA protein significantlyaffects the viral replication capacity and virulence of these two H1N1 swine influenza viruses. It is suggested that close monitoring for this residue should be paid in the future virological surveillance, so as to provide a scientific basis for better prevention and control of animal influenza, and even human influenza pandemic.

swine influenza virus; HA protein; amino acid; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.016

2020-12-31；

2021-03-30

国家自然科学基金面上项目（31872472）

杨时鳗，Tel：0451-51051684；E-mail：ysm196033@163.com。许程志，Tel：0451-51051684；E-mail：xucz1994@163.com。杨时鳗和许程志为同等贡献作者。通信作者乔传玲，Tel：0451-51051686；E-mail：qiaochuanling@caas.cn

（责任编辑 林鉴非）