精准检验医学和精准临床免疫学

高慧双　刘肖　程珍　宁永忠

摘要：随着新的检测技术的发展，新的医学概念——即个体化医学，又称精准医学，产生并迅速发展，同时也带动了精准检验医学概念的发展。本文主要阐述精准检验的一大分支——精准临床免疫学检测在各类疾病中的主要应用情况。

关键词：精准检验医学  精准临床免疫学  高通量基因检测（NGS）

[Abstract] With the development of new detection technology， a new medical concept-that is， individualized medicine， also known as precision medicine， has emerged and developed rapidly， and it has also led to the development of the concept of Precision Laboratory Medicine . This article mainly describes the main application of precision inspection， a major branch of precision laboratory Medicine， in various diseases.

[Key Words]  Precision Laboratory Medicine， Precision Laboratory Immunology， next-generation sequencing

随着2012年世界卫生组织宣布人类基因组计划完成，以及各种生物学检测技术的飞速发展，临床医学诊疗模式正在发生剧变。即从以前的传统医学（经验模式、循证医学模式）向现代化医学转变。而医学实践也正迅速的从传统的“视触叩听”的“疾病医学”（即生病了来医院就诊）向更为先进前沿的“健康医学”（即为预防疾病、寻求健康）转型。我们称之为“精准医学”或“个体化医学”、“personallized、predictive、preventive、participatory（4p）”医学。2015年美国提出了精准医学计划，其计划在短期内利用现有的基因库用于癌症的诊疗，远期目标是建立更多疾病相关的连接且得以应用。于是，“精准”这一概念也成为了近年来讨论比较多的一种新型的个性化医疗实践方向——本质上是聚焦于个体的基因层面、分子层面。从某种程度上说，精准医学可以称为未来医学发展的“雏形”。

一、精准检验医学

精准检验医学，“精准”顾名思义就是要在个体的基因、分子层面体现检验的“精确”和“准确”，做到有的放失。这一概念给目前的检验医学提出了新的挑战。新的理念也需要医生在恰当的时机，给恰当的患者，开具恰当的检查方法;而检验工作人员则运用恰当的辅助方法——尤其是基因检测方法、分子检测方法，提供恰当的检验数据，给医生诊疗提供帮助。这一检验过程，层层相加，环环相扣，缺一不可，体现了“精准医学”这一概念的内涵。

早在上个世纪70年代，精准医学这一理念就已经初步体现——那时美国称为“泡泡男孩”的一个小男孩，从出生便被诊断为严重联合免疫缺陷病（SCID）。医生根据其情况为了他制作了无菌膈膜房间，像一个“泡泡”一样，可以让他在里面与外界隔绝生活。虽然他在12岁时经骨髓移植治疗后不幸去世。但可以说，正是由于医生的个体化诊疗手段、精准施治，才让这一患有重疾的孩子得到了个体化的治疗，延续了宝贵的生命。

二、精准临床免疫学

临床免疫学检验作为检验医学的一重要分支，在许多疾病的诊断、治疗、防控等方面，提供了重要的依据，为临床诊疗准确性提供了重要保障。在众多免疫学检测中，肿瘤、血液系统疾病、器官、骨髓移植、自身免疫性疾病、過敏性疾病等精准免疫学检测，是临床诊断和治疗的重要环节。

众所周知，恶性肿瘤是一种细胞恶性分裂增殖的全身性复杂性疾病。其发病率和死亡率高，给社会和家庭带来了很大的社会和经济负担。目前临床上常用的如CEA、CA125、CA199、AFP、CA72-4等肿瘤标志物在疾病的特异性诊断治疗中，面对肿瘤的多样性和异质性，给予临床诊疗的指导性作用相对有限，且仅能提示肿瘤发生或复发的可能。引起肿瘤的病因复杂多样，其中基因变异是有高度特异性和异质性的重要因素。在肿瘤的诊疗过程中，如何做到在“海量”的基因信息中精准的“打捞”出突变基因、致病基因，是精准临床免疫学的难点。目前，高通量基因检测（high-throughput sequencing），又称为下一代测序技术NGS（next-generation sequencing）的发现和应用，解决了这一难题。采用高通量NGS技术手段，可以在庞大的未知序列信息条件下，迅速获取患者的癌细胞特有的基因变异信息（包括突变、融合基因等），从而甄别出变异信息，针对基因变异的位点，针对性的提供治疗方案。

例如，BRCA1和BRCA2是乳腺癌的两个易感基因，BRCA基因突变的检测可预测乳腺癌的患病风险。与散发性乳腺癌比较，BRCA1和BRCA2阴性的乳腺癌患者中，家族性乳腺癌≤30岁者所占的比例较高，且更易患双侧乳腺癌，提示该病存在着一定程度的遗传易感性;在治疗方面，有研究表明，BRCA1突变的患者对新的辅助化疗更加敏感，除此以外，BRCA1和BRCA2阴性的家族性乳腺癌患者也对新辅助化疗敏感。这些研究均为BRCA1和BRCA2阴性的家族性乳腺癌患者提供了新的个体化治疗方向。同时，乳腺癌基因检测可以将肿瘤的防治措施提前至易感阶段而不是发病阶段，这是个体化治疗的一大有利方向，美国影星安吉丽娜朱莉，在其家族性乳腺癌的背景下，提前做了易感基因检测，并且根据检测结果提前采取了预防措施，可谓是个体化预防，未雨绸缪。

错配修复基因MLH1、MSH2、MLH3等的突变可以是导致结肠癌、直肠癌发生的主要因素，且其表达与癌症病理分化程度密切相关。研究证实，MLH1表达缺失的患者发病年龄更早，肿瘤体积大，右半结肠比例相对较高，且伴有更高的淋巴结清扫数目。治疗方面，MLH3 rs175057与局部进展期直肠癌患者术前同步放化疗的敏感性相关，携带该位点T等位基因的患者比携带C等位基因的患者对治疗更敏感，而且这些患者的预后更好。MSH2 rs13019654位点与治疗的敏感性相关，但与患者的总生存无关。而MSH2的3个SNP位点与患者的总生存相关，因此，这些基因突变位点可以作为预测直肠癌患者术前同步放化疗敏感性的指标，而rs175057、rs3771273、rs10188090和rs10191478这4个位点可以作为预测直肠癌患者术前同步放化疗后总生存的指标。在肺癌的诊疗中，KARS、EGFR等多种分型基因突变，使得医生可以针对不同的基因突变位点制定相应的化疗方案，使用分子靶向药物，提高患者的生存期。

目前白血病等血液系统肿瘤的诊断和治疗也迈入精准医学时代。2012 年美国血液学会（American Society of Hematology，ASH）年会上关于测序（sequencing）的文献共有 643 篇;其中，应用 NGS 的文章就多达220 篇，涉及到急性白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、再生障碍性贫血、止血与血栓疾病等各类血液疾病。新一代测序技术的使用，使得急性淋巴细胞白血病（ALL）中多种新的融合基因、基因突变等重现性分子学异常的诊断可以被检测出来。同時，通过NGS手段可以精准的指导临床选择靶向药物、评估预后分层以及急性淋巴细胞白血病（ALL）微小残留病（MRD）等预后监测。例如检测到NR3C1、CREBBP、TP53、NT5C2等基因突变，则提示ALL疾病的复发及耐药。由此指导临床精准治疗。

HLA（ Human leukocyte antigen）分型技术目前已广泛应用于实体器官移植、造血干细胞移植供受者组织相容性配型、造血干细胞捐献者库建设、药物个性化选择、群体遗传多态性和某些疾病关联等的研究。传统的HLA基因分型技术使用的是HLA 核苷酸序列测定法 （ polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR- SBT）。但由于HLA高度多态性、等位基因同源性等因素的影响，其在应用过程中存在一定的模糊制定问题。随着HLA分型技术不断深入发展，新一代测序平台已应用于HLA基因分型，实现了高通量和快速精准检测。并且可以有效的避免传统PCR-SBT的技术限制。当然任何一种方法都不会完美无缺，有学者指出NGS在应用于HLA基因分型过程中存在一定程度的等位基因扩增不平衡和丢失现象。需要进一步发展来克服该弊端。

自身免疫性疾病 （AID） 是一大类与免疫系统功能障碍和异常免疫反应相关的不同病症，是一种累及多器官多组织的一类全身性疾病。实验室目前的检测指标如抗核抗体谱、抗中性粒细胞抗体谱、抗心磷酯抗体等多指向特定的自身免疫疾病，但往往多年来，研究人员和临床医生一直在寻求特定的临床和实验室特征来定义自身免疫性疾病并更精确地进行诊断。精准医学可以使用分子谱并独立于临床诊断来确定进行早期治疗和预防组织损伤的方法。由于患者自身免疫状况，相较于健康人群来说更易感染各类病原体，且往往合并重症感染，在临床治疗方面，需要更大剂量种抗生素来治疗。然而，自身免疫病患者体内免疫感染的致病菌较多，常规的培养检定方法不能完全鉴别，往往耗时较长。此时，NGS方法得以应用，其优势则体现出来，在此类患者标本中检测致病菌，尤其是病毒或真菌时，其有这独特的诊断敏感性、特异性和检验时效方面的优势。

精准临床免疫学在过敏性疾病中的应用是近几年新兴的精准方向。哮喘、鼻炎和特应性皮炎特应性皮炎、食物药物过敏性疾病的传统的治疗往往依赖病史、临床检查和过敏源测试等的结果。而针对过敏性疾病的治疗反应或疾病病程、患者自身的免疫状态灯因素随着时间推移，其个体临床差异不尽相同，而传统的“一刀切”模式的治疗手段往往达不到预期效果。NGS等技术，结合体外功能测试，能够极大地帮助我们了解特应性相关的潜在机制。而精准临床免疫学则从病理生理学、遗传学、药理学、生理学、生物学和/或免疫学等多角度对病例进行详细分析，基于每一例证据进行更具体的指导治疗。例如，有研究表明，职业或环境中的低分子量物质导致上皮来源的TSLP、IL-33和IL-25的释放，可启动或加重2型免疫反应，从而加重Ⅱ型免疫反应性鼻炎。某些基因突变、遗传变异、基因突变的表观遗传变化与食物过敏的早期发作有关。基于这些研究，可确定过敏分型、发生过敏的风险、过敏反应严重程度和治疗预后的敏感和特异性生物标志物，由此导向精准治疗。

综上，以NGS检测技术为依托的精准临床免疫学检验已成为检验医学进展最快的一个领域。目前，我国一些基础及临床实验室，部分第三方检测机构也已开展相关检测项目，如肿瘤检测（早期筛查、诊断、预后、治疗、监测等）;免疫缺陷疾病等。非肿瘤检测如产前筛查、新生儿筛查及诊断遗传病诊断等遗传学、药物基因组学及感染学检测方面广泛应用及开展研究。与此同时，也有部分诊断试剂盒获批上市。

随着NGS技术和生物技术的继续发展，基于单分子测序和合成法测序的第三代测序平台也从研究阶段逐步走向应用阶段，如无需扩增，实时捕获信号的Pacific Biosciences公司的单分子实时合成测序技术（single molecule real-time，SMRT）和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术。三代NGS技术的优点是缩短了实验准备时间，能够有效避免一些系统错误，但由于方法不够成熟，制作材料要求高等因素，目前还未广泛推广使用。

NGS技术对于精准检验医学其他分支贡献也颇为可观，如NGS在心血管疾病诊断等方面，也取得了相应的进展。同时，目前已有针对NGS技术在病原体感染疾病方便应用的专家共识发布，有诸多其他文献在这些方面均全面报道和解读，在此不再赘述。随着科技的发展，相信NGS技术会成为未来检验医学的主要诊断手段和金标准，以满足精准医学不断进展的需求与变化。

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