新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后NLRP6炎症小体的变化

聂影

摘要：目的：通过制备新生Sprague-Dawley大鼠缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic ischemic brain damage，HIBD）的动物模型。测定HIBD在不同时间点脑组织中NLRP6，Cleaved-caspase-1，IL-18，IL-1β的表达。方法：选择7日龄SD大鼠120只作为研究对象，将其随机分为3组，每组40只，空白组、假手术组、缺氧缺血性脑损伤组（HIBD组），在第6h、24h、48h、72h、7d取材，建立动物模型，行免疫组化分析、蛋白免疫印迹、PCR检测。结果：空白组、假手术组无阳性IL-1β、IL-18蛋白表达，Cleaved-caspase-1表达水平低，NLRP6、Caspase-1中的mRNA水平最低。HIBD组IL-1β、IL-18蛋白表达水平增加，72h最为显著，HIBD组Cleaved-caspase-1表达水平逐渐增加，72h最为显著，HIBD组NLRP6、Caspase-1的mRNA处理水平也开始显著提高，72小时达到高峰，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：7日龄新生儿SD大鼠模型建立成功且有实验意义。随着时间损伤逐渐加重，与NLRP6、Cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18的表达上调存在相关性。

1 材料和方法

1.1 材料

选择7日龄SD大鼠120只作为研究对象，将其随机分为3组，每组40只，空白组、假手术组、缺氧缺血性脑损伤组（HIBD组），所有大鼠体重范围在（200±20）g，由长春市亿斯实验动物科技公司生产供应。佳木斯大学实验动物研究中心饲养，120只大鼠无性别差异，体重在（13±2）g范围内。试剂及器械均有佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2 方法

动物模型建立：HI组： 参照改良Rice-Vannuncci法建立模型，具体流程包括：行左侧颈总动脉结扎后，92 % N+8 % O混合气体缺氧处理2.5 h，建立缺氧缺血脑损伤模型;Sham组：仅将左侧颈总动脉钝性分离，不给予结扎，不行缺氧缺血处理;Control组：不做任何处理。HE染色，尼式染色，免疫组化分析，WesternBlot和荧光定量PCR检测组脑组织标本采集均需在冰上操作，随后将其置入-80℃的低温冷冻冰箱贮存备用。

1.3 统计学处理

应用统计学软件SPSS21.0分析实验数据，计数资料采取卡方检验，用率（n%）表示，计量资料行t检验，用（均数±标准差）表达，若P<0.05，证明统计学意义存在。

2 结果

行为学：与空白组、假手术组相比，HIBD组有呼吸急促，站立不稳等症状，缺氧后大鼠无法翻身。

HE病理学形态染色：空白组、假手术組在不同时间点下表现为形态丰富，层次清晰，数量正常，无病理变化。HIBD组6h后层次混乱，数量下降，24h脑卒中区域怀素，神经元数量下降，48h脑组织区域出现明显组织坏死，神经元丢失，72h可见局灶坏死神经元细胞和固缩，7天可见胶质细胞增生。

尼氏形态学染色：空白组、假手术组神经元细胞胞体饱满，清晰可见细胞核，HIBD组神经元细胞有损伤，细胞核溶解。

免疫组织化学染色：空白组、假手术组无阳性IL-1β、IL-18蛋白表达，HIBD组IL-1β、IL-18蛋白表达水平增加，72h最为显著，差异有统计学意义（P<0.05）。

蛋白免疫印迹：空白组、假手术组Cleaved-caspase-1表达水平低，HIBD组Cleaved-caspase-1表达水平逐渐增加，72h最为显著，差异有统计学意义（P<0.05）。

PCR检测：空白组、假手术组 NLRP6、Caspase-1中的mRNA水平最低，HIBD组NLRP6、Caspase-1的mRNA处理水平也开始显著提高，72小时达到高峰，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

新生儿缺氧缺血性脑损伤是新生儿死亡的主要原因，该病症不仅影响新生儿的生活质量，且给患儿家庭与社会带来负担。相关学者研究分析，炎症是导致新生儿缺氧缺血性脑病发展的关键因素，疾病不断发展，炎症也会不断加大对脑实质细胞的损伤，进而引发继发性脑组织损害。新生儿HIE中具体机制目前尚不确定，适应性免疫在其中发挥了关键的作用，越来越多的研究证实：T细胞在慢性炎症中发作重要作用，而B细胞可通过抗炎因子对HIE后炎症和组织修复发挥保护作用。由此可说明，炎症参与了脑损伤，且在修复与恢复中也有显著作用。

炎症小体是细胞内多种蛋白质组成的蛋白复合体，可对促进因子IL-1β和IL-18进行激活，并引起宿主的炎症反应。对炎症进行分析，发现其是有NLRPl-NLRPl4等共十四个亚亲族构成，包含NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2等为主体的炎性细胞小体，其中以NLRP6最为集中，因为其具有正向调节作用功能，可维持上皮完整性，抑制癌物质和神经炎症，还可使pro-IL-18，pro-IL-1β成为有活性的IL-18和IL-1β，加速炎症反应。NLRP6 在多种炎症性疾病和宿主防御机制中发挥重要作用，有学者研究表明NLRP6 炎性小体的表达在大鼠中被上调，可激活CLeaved-Caspase-1 信号传导，引起神经炎症，通过 siRNA 干扰了 SE 大鼠大脑中的NLRP6 和 CLeaved-Caspase-1 ，具有神经保护作用。而本次研究结果表明：空白组、假手术组无阳性IL-1β、IL-18蛋白表达，Cleaved-caspase-1表达水平低，NLRP6、Caspase-1中的mRNA水平最低，HIBD组IL-1β、IL-18蛋白表达水平增加，72h最为显著，HIBD组Cleaved-caspase-1表达水平逐渐增加，72h最为显著，HIBD组NLRP6、Caspase-1的mRNA处理水平也开始显著提高，72小时达到高峰，由此可证实：7日龄新生儿SD大鼠模型建立成功。HIBD随着时间损伤逐渐加重，与NLRP6、Cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18的表达上调存在相关性。

参考文献：

[1]杜婷. 新生小鼠缺氧缺血性脑损伤后伴发白内障的研究[D].昆明医科大学，2020.

[2]闵颖俊，赵俊雄，彭行，曾祥菲，颜琳，华海蓉，毛榕榕，金会艳，李凡.小胶质细胞参与新生儿缺氧缺血性脑损伤所致突触异常的研究[J].中国病理生理杂志，2021，37（03）：385-392.