Klotho基因在不典型膜性肾病患者中的表达意义及对OPN水平、 血栓弹力图的影响①

赵翠，贾利敏，王自强，房晓芳，魏迪，郭铁标，陈保春

沧州市人民医院 医专肿瘤院区， 肾病内科， 河北 沧州 061000

膜性肾病依据发病机制可分为不典型膜性肾病、 原发性膜性肾病、 继发性膜性肾病等， 临床表现为肾病综合征(大量蛋白尿、 低蛋白血症、 高度水肿、 高脂血症)， 或无症状、 非肾病范围的蛋白尿， 病程中可出现肾功能不全、 高血压等． 不典型膜性肾病是指病因不明确的膜性肾病， 且患者患病率明显升高[1]．Klotho基因是一种与衰老有关的基因， 研究显示其与肿瘤细胞生长、 转移、 凋亡等均有一定关系， 但其对肾病患者的作用机制尚不清楚[2]． 血清骨桥蛋白(OPN)可由人体内多种细胞合成分泌， 可积极调节机体器官组织的发育[3]． 此外， 肾病综合征患者常见血液高凝状态， 血栓弹力图指标可准确检测患者凝血因素异常情况[4]． 本研究利用免疫组织化学法对Klotho基因mRNA表达情况进行检测， 并探讨其对患者OPN、 血栓弹力图的影响．

1 材料与方法

1.1 实验材料

设2018年1月至2020年1月沧州市人民医院医专肿瘤院区肾内科收治的100例肾穿刺活检标本诊断为不典型膜性肾病患者为观察组， 同时纳入30例尸解未出现明显肾脏病变的肾组织标本为对照组． 观察组标本经福尔马林固定， 行石蜡包埋切片； 对照组标本经2.5%戊二醛进行固定， 使用Epon包埋． 本研究已获沧州市人民医院伦理委员会通过(伦批2017025)．

1.2 方法

1.2.1 染色

Klotho免疫组化染色试剂盒购自赛默飞世尔， 对照组使用PBS溶液代替一抗． 严格按照说明书进行染色： ①脱蜡至水； ②使用蒸馏水配制3%甲醇过氧化氢(H2O2)20 mL， 并使用蒸馏水洗3次； ③使用微波抗原修复； ④滴加兔抗人一抗， 4 ℃下过夜， 使用PBS溶液洗3次； 滴加生物素化山羊抗兔IgG， 室温下反应1 h， 使用PBS溶液洗3次； ⑤滴加SABC复合物， 室温下反应1 h； ⑥加入DAB试剂， 使用苏木素复染， 脱水封片．

Klotho基因mRNA原位杂交试剂盒购自赛默飞世尔， 严格按照说明书进行操作： ①石蜡切片后经酒精脱蜡入水， 加入3% H2O2室温下反应10 min， 使用蒸馏水洗2次； ②滴加3%柠檬酸1 mL及2滴浓缩胃蛋白酶， 于37 ℃下反应15 min， 使用PBS溶液进行清洗， 共3次， 5 min/次， 蒸馏水清洗1次； ③滴加预杂交液， 于37 ℃下反应3 h， 滴加杂交液， 于37 ℃下反应过夜， 使用SSC进行清洗； ④于37 ℃下滴加封闭液， 30 min后甩去多余液体， 并滴加SABC溶液， 37 ℃下反应30 min， 使用PBS溶液洗4次， 5 min/次； ⑤滴加生物素化过氧化物酶， 37 ℃下反应30 min， 使用PBS溶液清洗4次， 5 min/次； ⑥DAB显色10 min， 加入苏木素复染， 脱水封片．

1.2.2 图像分析

对两组患者免疫组化染色切片及杂交染色切片进行检测， 检测范围为肾小管及肾小球． 每张切片随机选取3～5个肾小球， 并选取3个视野进行检测， 分别检测肾小球及肾小管的吸光度值， 并以平均值进行计算．

1.2.3 分组

根据观察组细胞染色强度与阳性细胞比例进行计分， 染色强度可以分为0～3分， 0分为阴性； 1分为淡黄色颗粒； 2分为棕黄色颗粒； 3分为褐色颗粒． 阳性细胞水平评分： 0分： 阳性细胞R≤5%； 1分： 5%75%． 将两项分数相乘得到分组标准， 将乘积M≤4分记为阴性组， 其余记为阳性组．

1.2.4 OPN水平及血栓弹力图

使用3%H2O210 mL， 高压锅抗原修复3～5 min， 使用4 ℃一抗孵育过夜， 加入二抗进行37 ℃孵育15 min， 加入氧化物酶液-链霉素抗生物素进行37 ℃孵育15 min． 加入DAB显色， 使用苏木素染色1 min， 加入0.5%～1.0%盐酸乙醇进行分化， 脱水封片．

使用WITEYE T10000血栓弹力图分析仪(武汉中科和信生物技术有限公司)检测阴性组、 阳性组血栓弹力， 检测指标包括凝血时间、 凝血指数、 最大血栓弹力度、 凝固角．

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组Klotho基因蛋白量比较

对照组肾小管上皮细胞仅为微弱阳性反应， 阳性颗粒仅见于肾小管上皮细胞胞浆内； 肾小球为阴性反应， 肾小球间质内未见明显阳性反应． 观察组患者Klotho基因呈强阳性表达， 与对照组相比， 差异有统计学意义(p<0.05)， 见表1．

表1 两组Klotho基因蛋白量比较

2.2 两组Klotho基因mRNA原位杂交染色比较

对照组肾小球未见Klotho基因mRNA阳性表达， 肾小管见极弱阳性表达． 观察组肾小管上皮细胞呈强阳性表达(p<0.05)， 肾小球与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)， 见表2．

表2 两组Klotho基因 mRNA原位杂交染色比较

2.3 阴性组及阳性组OPN蛋白表达情况比较

阳性组有82例， 阴性组有18例． OPN主要在血管内皮、 血管平滑肌、 肾小管粘膜上皮等上表达． 阳性组OPN蛋白表达水平远高于阴性组， 组间数据相比差异有统计学意义(p<0.05)， 见表3．

表3 阴性组及阳性组OPN蛋白表达情况比较

2.4 阴性组及阳性组血栓弹力图检测结果比较

阳性组凝血指数、 最大血栓弹力度、 凝固角显著高于阴性组， 凝血时间显著低于阴性组， 组间数据相比差异有统计学意义(p<0.05)， 见表4．

表4 阴性组及阳性组血栓弹力图检测结果比较

3 讨论

不典型膜性肾病常为隐匿起病， 患者主要病理表现为肾小球基底膜增厚伴有上皮细胞下免疫复合物沉积， 主要表现为高血压、 肾功能不全等． 患者常处于血液高凝状态， 因此血栓栓塞是其常见并发症[5-6]． 目前临床上发现不典型膜性肾病患者治疗效果较差， 因此积极探讨其发病机制及临床生理特点是研究的重点所在．

本研究共收集100例不典型膜性肾病患者肾穿刺活检标本， 并对其Klotho基因进行研究．Klotho基因是一种与衰老有关的基因， 有研究指出， 小鼠缺乏Klotho基因后会出现骨质疏松、 肺气肿、 动脉硬化等综合征[7]． 李莉等[8]研究指出， 大鼠心、 肾组织Klotho基因表达水平降低， 会影响其内皮功能， 从而影响肾脏功能． 邹新蓉等[9]研究发现， 大鼠肾损害氧化应激反应与Klotho基因水平有关， 通过使用抗氧化药物可有效上调Klotho基因的表达水平， 从而减轻大鼠的临床症状． 同时， 许多研究结果发现，Klotho基因蛋白表达水平升高时可保护肾脏[10]． 邵齐等[11]在培养的肾小球细胞中加入Klotho基因后， 发现上皮细胞合成纤维连接蛋白明显增多， 提示Klotho基因可刺激肾小球上皮细胞合成细胞外基质． 本研究结果显示， 对照组肾小管上皮细胞仅为微弱阳性反应， 阳性颗粒仅见于肾小管上皮细胞胞浆内， 肾小球为阴性反应， 肾小球间质内未见明显阳性反应， 观察组患者Klotho基因mRNA表达呈强阳性(p<0.05)． 此外，Klotho基因蛋白表达不仅在肾小球， 同时在肾小管上皮细胞胞浆内也有表达， 提示Klotho基因对肾小管、 肾小球均有一定影响[12]． 同时， 本研究结果显示Klotho基因mRNA表达水平在肾小管内表达水平较肾小球内更明显， 与王健富等[13]研究结果一致． 有研究表明[14]， 对肾病患者肾脏中Klotho基因mRNA表达水平检测中发现， mRNA表达水平主要分布于人肾小管及集合管上皮细胞内， 且阳性信号高于肾小球． 本研究结果提示患者出现肾小管的改变可能对肾间质纤维化起到重要作用． 董照瀛等[15]研究发现自发性高血压大鼠体内Klotho基因mRNA表达水平上调， 可导致大鼠心肌胶原纤维化水平、 心肌细胞厚度、 高血压肾损害明显减少， 提示Klotho基因还可减缓心脏损害．

OPN是一种位于常染色体上的蛋白质， 且存在于人体内不同组织及不同细胞中． 邢艳阳等[16]指出， OPN表达受到雌激素及孕酮的影响． 庞春艳等[17]指出， 表皮生长因子可通过特定的信号途径调控OPN mRNA表达． OPN主要通过依赖特定序列与细胞表面特异受体进行结合， 从而直接或间接促进淋巴细胞、 巨噬细胞的趋化作用， 从而诱导巨噬细胞分化IL-12等． 黄雨茅等[18]通过建立不典型膜性肾病模型发现， OPN在肾小管间质受损区域表达上调， 同时有大量巨噬细胞浸润． 孔繁达等[19]通过动物研究证实， 肾小管间质中OPN表达增加可促进巨噬细胞浸润， 从而加快肾小管损伤， 加重体内炎症反应． 本研究根据Klotho基因mRNA阳性细胞数及染色强度将观察组分为阳性组(82例)和阴性组(18例)， 结果显示OPN主要表达于血管内皮、 血管平滑肌、 肾小管粘膜上皮等， 阳性组OPN蛋白表达水平远高于阴性组(p<0.05)． 此外， 有研究[20]指出， OPN水平与肿瘤的转移与发展有重要关系， OPN在肾脏肿瘤患者中表达明显增加． 但OPN与肾脏肿瘤患者中的表达水平尚无足够临床研究． 但刘明等[21]指出， OPN与MMP-2因子的表达有一定关系， 且对肿瘤良恶性有一定指征反应， 因此可使用OPN水平初步对肾脏肿瘤患者进行筛选等．

肾病综合征患者常见血液高凝， 因此临床上常使用血栓弹力图对血凝状态进行检测， 从而动态评估血液凝块、 纤维蛋白的形成， 并积极反应血凝块的动态变化[22]． 本研究显示， 阳性组凝血指数、 最大血栓弹力度、 凝固角显著高于阴性组， 凝血时间显著低于阴性组(p<0.05)， 提示Klotho基因阳性表达组患者凝血状态较阴性组异常程度更高． 血管内皮细胞在受损状态下会合成并分泌一种叫内皮素的物质， 从而产生强烈的缩血管反应， 引起动脉收缩、 肾功能受损、 高凝状态等， 而Klotho基因mRNA此时在肾的表达减少， 而内皮素蛋白表达增加， 从而加剧了病情的发展[23-24]．

本研究由于条件有限， 样本数较小， 同时观察组患者进行肾穿刺活检时可能由于时机不同对结果产生了一定的影响． 因此， 进一步研究还需加强对患者的随访， 密切关注患者Klotho基因表达情况与治疗效果的关系， 从而增加对疾病机制的认知， 改善患者预后效果． 综上所述，Klotho基因mRNA表达水平在不典型膜性肾病患者中显著升高， 且会升高患者OPN水平， 并影响血液凝固状态．